福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

青枯雷尔氏菌致病性的代谢组学异质性研究

采用基于LC/Q-TOF MS的代谢组学方法,对不同致病性青枯雷尔氏菌的胞外代谢物进行了分析,获得了具有显著性差异的代谢标志物,并采用PCA数据处理方法对不同致病性菌株进行分类,建立致病性的PLS-DA预测模型。结果表明,该方法可以从代谢水平上区分野生型强致病力菌株、野生型无致病力菌株以及强致病力菌株经Tn-5转座子插入导致致病力丧失的人工致弱突变菌株。对代谢标志物的差异分析结果表明,在无致病力菌株和Tn-5致弱菌株中,有12种代谢标志物与强致病力菌株具有显著性差异(P<0.05,FC≥2),并表现出相同的丰度变化趋势,预示着这些代谢标志物可能与青枯雷尔氏菌的致病性有关。     

青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究

采用不同浓度的强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91处理番茄盆栽苗,建立青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法.结合菌落形态和特异性引物鉴定结果说明所分离得到的菌株均为强致病力青枯雷尔氏菌.当番茄植株培养至第5d时,4个不同接种浓度处理的番茄植株苗均出现发病症状.采用104 cfu·mL-1处理的番茄植株在第4d发病,但到第8d,...     

不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄代谢产物的异质性研究

采用基于气相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法 ,研究不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄植株代谢物变化的异质性。将青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91和无致病力菌株FJAT-1458分别单独接种和混合接种番茄植株,以清水为对照,接种后6、24、48、72、96h取样,测定番茄植株代谢产物的变化。结果表明,检测到的代谢物种类主要为醇类、酯类、酸类、醛类、吡啶类和烷烃类。不同处理番茄代谢产物组成变化的时间动态结果表明,FJAT-91单独接种处理48h、FJAT-1458单独接种处理48h、同时接种FJAT-91和FJAT-1458处理96h及对照处理72、96h的番茄中检测到代谢物种类最多,分别为12、18、15和15种。邻苯二甲酸二丁酯在不同处理不同时间的番茄中均检测到,为完全分布类型,其他代谢物为不完全分布类型。FJAT-91单独接种处理能诱导番茄代谢产物棕榈酸消亡,而FJAT-1458单独接种或与菌株FJAT-91混合接种及对照处理的番茄植株该代谢物维持在相当含量,说明该代谢物可能与植株免疫抗病有关。主成分分析表明,不同接种处理诱导番茄植株的代谢谱存在一定的差异,主成分一和主成分二基本上能将其区分开来。     

拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47...     

茄子3株内生细菌分别与青枯雷尔氏菌混合培养特性研究

采用混合培养的方法,研究3株茄子内生细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,FJAT-943)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis,FJAT-946)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus,FJAT-964)与青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,FJAT-1305)数量消长动态。筛选优化培养基配方为:葡萄糖5g.L-1,酵母膏5g.L-1,蛋白胨10g.L-1。混合培养条件下,各菌株生长数量均低于单独培养。菌株FJAT-943和菌株FJAT-1305混合培养体系中,菌株FJAT-1305不能生长;菌株FJAT-946与菌株FJAT-1305混合培养3d,菌株FJAT-1305生长数量为7.40×109 cfu.mL-1,显著低于单独培养的9.78×109 cfu.mL-1;菌株FJAT-964与菌株FJAT-1305混合体系中,生长数量与单独培养均无显著差异。菌株FJAT-943、FJAT-946对菌株FJAT-1305具有显著抑制作用。     

桑青枯雷尔氏菌gsp G和gsp K基因的获取与生物信息学分析

gsp G和gsp K参与青枯雷尔氏菌Ⅱ型分泌系统周质复合体的形成。本研究以桑青枯雷尔氏菌MR111为材料,利用PCR扩增和DNA测序技术成功获得其gsp G和gsp K基因438 bp和843 bp的序列,在线BLAST分析两个基因编码蛋白与其它青枯雷尔氏菌同源区域的相似性在90%以上。在线CDD分析两个蛋白除分别含有典型的T2SG和T2SK以及N端主要由亮氨酸和丙氨酸组成的分泌型信号肽外,gsp G还含Ⅳ型分泌系统的"Ⅳ_pilin_GFxxx E"结构,而在gsp K中则出现了重复的"GIQSTE"序列,该序列在雷尔氏菌属中高度保守。     

青枯雷尔氏菌在芝麻植株内的分布及消长动态

芝麻青枯病是我国南方芝麻生产上的重要土传病害。通过测定健康植株、不同发病时期的自然病株及人工接种病株内不同部位青枯雷尔氏菌数量,旨在明确病菌在芝麻植株内的分布及消长动态。结果表明:发病初期,病株内青枯雷尔氏菌总数量随着病情的发展而增加,之后随着病情严重度的加重而下降。病菌的致病力则随着病情发展呈现持续上升的趋势。检测的所有芝麻健株各部位均无青枯雷尔氏菌分布,说明芝麻植株不存在无症状侵染现象。青枯雷尔氏菌在芝麻病株内的分布呈现丰富的多态性,自然病圃和灌根接种的Ⅱ类、Ⅲ类病株各部位菌量分布随着植株高度的升高而递减,但其Ⅰ类病株中下部菌量却高于基部。针刺接种的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类病株,接种点以下的根部和基部均有青枯雷尔氏菌分布,说明青枯雷尔氏菌不仅可随植物蒸腾向上扩散,也可向下蔓延。     

桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因的获取与结构分析

Gsp F是细菌Ⅱ型分泌系统的内膜平台的重要蛋白,利用PCR扩增技术,获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的含有该类基因功能性结构域的Gsp F基因。NCBI在线BLASTP分析发现,该基因与雷尔氏菌属来源的同源基因的一致性在90%以上;在聚类分析中,首先所有雷尔氏菌属同源基因聚合在同一分支,后与皮氏罗尔斯顿菌的同源基因聚合。基因结构分析表明,该基因有2个由α螺旋组成的具有高度相似性的、跨膜胞质结构域,揭示该基因可能参与细菌的跨膜分泌。     

转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性

【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。     

2 个烟草青枯病菌菌株的致病力差异与基因组比较分析

【目的】探索比较 2 个不同青枯病菌菌株之间致病力差异和基因组差异,分析影响菌株致病力差异的关键基因,为烟草青枯病的防治提供理论参考。【方法】从烟草青枯病发病烟株上分离获得不同的青枯病菌菌株并进行鉴定,通过侵染试验比较 2 个菌株之间的致病力差异,并对 2 个菌株的基因组进行测序,比较二者之间基因组序列差异,分析影响菌株致病力差异的基因。【结果】从江西省抚州市广昌县和南丰县分离到2 株青枯病菌菌株 RsTP2 和 RsTY2,egl 测序表明菌株 RsTP2 和 RsTY2 均属于亚洲分支演化型Ⅰ中的序列变种13,其中菌株 RsTP2 对云烟 87 致病力较强,而菌株 RsTY2 致病力较弱。通过对 2 个菌株进行基因组测序,获得二者的基因组框架图,其基因组大小分别为 5.43 MB 和 5.23 MB。将获得的基因和蛋白序列与相关数据库进行比对,获得基因的功能及物种注释信息。通过分析发现,菌株 RsTY2 有 52 个蛋白和菌株 RsTP2 的 44 个蛋白比对后序列存在差异,其相似度在 50.00%~99.88%,其中存在较大差异的编码蛋白主要是凝集素类蛋白,其次是细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白。【结论】通过比较不同致病力青枯病菌株 RsTP2 和 RsTY2 的基因组序列差异,发现二者基因组中编码凝集素类蛋白、细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白等蛋白序列差异较大,这类编码蛋白主要参与细菌的黏附、膜溶解、穿透等功能,与细菌侵入宿主细胞的能力关系密切。这几类编码蛋白的差异推测是导致菌株 RsTP2 和 RsTY2 致病力差异的重要因素之一。     

广东省烟草青枯菌的菌系和遗传多样性

从广东省韶关和梅州2个烟草产区采集了来自8个县市的共38个烟草青枯菌菌株,对病菌的生物型、致病型和遗传多样性进行了测定,结果表明广东烟草青枯菌全部为生物型Ⅲ。通过在红花大金元,K326,岩烟97和系3等4个烟草鉴别品种上的致病性反应,将广东烟草青枯菌分为强致病力、中等致病力和弱致病力3种致病型,其中以中等致病力菌株为主,占78.9%;强致病力菌株占13.2%;弱致病力菌株占7.9%。从116个RAPD通用引物中筛选出10条引物,用于对38个烟草青枯菌株DNA的RAPD分析,扩增条带表现出明显的多态性,条带主要聚集在0.3～4.0 kb之间。聚类分析这38个菌株可分为2个组群,即组群A和组群B。组群A中又可以分为7个亚组(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7);组群B也含有4个亚组(B1、B2、B3、B4)。研究结果还表明,广东烟草青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的寄主来源有一定的相关性,但与地理区域、生物型和致病型没有明显的相关性;生物型不能反映烟草青枯菌菌系的差异。     

广东省烟草青枯茵的菌系和遗传多样性

从广东省韶关和梅州2个烟草产区采集了来自8个县市的共38个烟草青枯菌菌株，对病菌的生物型、致病型和遗传多样性进行了测定，结果表明广东烟草青枯菌全部为生物型Ⅲ。通过在红花大金元，K326，岩烟97和系3等4个烟草鉴别品种上的致病性反应，将广东烟草青枯菌分为强致病力、中等致病力和弱致病力3种致病型，其中以中等致病力菌株为主，占78．9％；强致病力菌株占13．2％；弱致病力菌株占7．9％。从116个RAPD通用引物中筛选出10条引物，用于对38个烟草青枯菌株DNA的RAPD分析，扩增条带表现出明显的多态性，条带主要聚集在0．3～4．0kb之间。聚类分析这38个菌株可分为2个组群，即组群A和组群B。组群A中又可以分为7个亚组（A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7）；组群B也含有4个亚组（B1、B2、B3、B4）。研究结果还表明，广东烟草青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的寄主来源有一定的相关性，但与地理区域、生物型和致病型没有明显的相关性；生物型不能反映烟草青枯菌菌系的差异。 04—0463—06     

烟草青枯病菌生防菌的筛选和鉴定

采用纸碟片法筛选到4株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b,抑菌圈直径分别为51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。通过16S r DNA序列分析,C2c、C1a和Tsb为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),Ch1b为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。这4株生防菌对烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果霉心病菌(Trichothecium roseum)等病原真菌也有较好的抑制作用。     

青枯雷尔氏菌致病机制及其相关基因的研究进展

阐述青枯雷尔氏菌致病基因以及它们之间的相互调节。由于青枯雷尔氏菌的复杂性,进而发展了许多青枯雷尔氏菌分子鉴定技术,并且对青枯雷尔氏菌的鉴定逐渐走向快速、便捷和灵敏高的趋势。青枯雷尔氏菌基因组约5.8Mb,具有高(G+C)含量和约5 120个可能的编码基因;它是由3.7Mb的染色体和2.1Mb的大质粒所组成,主要的致病因子有Ⅲ型hrp分泌系统产物、胞外多糖、细胞壁降解酶(包括果胶质酶以及纤维素酶等),其涉及的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因;青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)、II型分泌系统(T2SS)等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。同时,T3SS和T2SS之间也是相互影响的。上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的,并以PhcA调节基因的启动和转录为核心,自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭,从而控制细菌的生长状态。     

云南马铃薯青枯病菌的毒力和致病力变化

用分离自云南省8个县(市)的马铃薯青枯病病菌273个菌株对马铃薯植株接种，测定马铃薯青枯病病菌对马铃薯的致病性。发现来自宣威的菌株在毒力和致病力方面均比昆明地区的强。对来自云南的主栽品种发病的标本分离接种显示：来自米拉、合作88、会-2的菌株因地区差异，70％～90％具有致病性，由于这些都是长期种植的老品种，所以加大品种带菌检测势在必行。     

姜瘟致病菌高毒力菌株及拮抗菌的分离

[目的]筛选强拮抗能力强的芽孢杆菌。[方法]从山东莱芜采集病姜及附近土壤中分离出姜瘟致病菌高毒力菌株,并利用芽孢杆菌进行了拮抗试验。[结果]LW-4、LW-7、LW-32这3株菌对姜瘟致病菌有较强的拮抗能力,其抑菌圈面积较其他菌株大。[结论]为防治姜瘟病提供了理论依据。