小麦茎生长点转化研究初报

为了躲避转基因技术对组织培养的过分依赖,本研究以小麦为材料尝试了一种对生长点直接进行转化的方法,并初步证明了这一方法的可行性。具体做法是：将种子萌芽,然后剥去胚芽鞘暴露出生长点,再用玻璃纤维制作的小刷子将生长点刺伤,最后用带有外源基因的农杆菌进行侵染处理。用携带hph-GUS基因的LBA4404农杆菌,侵染处理1～11日龄幼苗(生长点),共培养7d后检测新生芽中GUS的瞬时表达情况;侵染1～2日龄幼苗(生长点),取长成植株的2～3朵小花进行GUS稳定表达检测。又用携带BADH和npt Ⅱ基因的AGL1农杆菌菌株侵染1日龄的幼苗(生长点),在含：100mg／L卡那霉素的蛭石中进行选择。结果表明,GUS的瞬时表达率随被处理幼苗的日龄增加而降低,以2日龄幼苗为最高(10．7％)。用花序检测GUS的稳定表达,被侵染受体为1日龄幼苗时的表达率高于2日龄的幼苗。蔗糖的存在并不提高GUS基因在花序中表达的频率。不过花序表现为GUS阳性的植株后代,经PCR检测后并没有证实GUS基因存在。用AGL1菌株进行转化,获得了13．6％的抗卡那霉素的绿色植株,但只有3株呈现PCR阳性,且只有1株结了实。     

基因枪转化小麦不同受体的研究

用基因枪进行ｇｕｓ基因转化,研究了小麦幼惠,幼胚愈伤组织不同诱导培养时间的转化效果。结果表明,幼穗以诱导培养１６ｄ的转化效益最佳,幼胚以诱导培养１５ｄ的转化效果最好,比较幼穗和胚的组织培养结果发现,幼穗较幼胚更继代和形成再生植株。     

小麦幼胚培养对春化的影响

植物胚培养的研究与应用已有近一个世纪的历史 ,但过去的胚培养主要用于远源杂交胚拯救和幼胚外植体诱导愈伤组织 ,国外一些学者对小麦幼胚诱导的愈伤进行了春化研究 ,结果表明幼胚愈伤能够接收春化 ,在国内 ,还未见有关幼胚春化的研究 ,对于不同的品种 ,哪个胚龄接种最好 ,最易接受春化 ,以及不同激素水平的培养基对不同胚龄的胚春化的影响都有待研究 ,我们选取了华北地区有代表性的几个品种就此进行了初步研究。如果胚龄越小越易接受春化 ,那么就为从春化处理入手解决加速发育问题打开了突破口。1　材料和方法在初试的基础上 ,选择 6个冬…     

小麦幼胚组织培养研究进展

小麦组织培养是利用基因工程改良小麦品种的重要基础和保证,小麦幼胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要的意义。以幼胚为外植体进行小麦组织培养的方法被大多数学者认为是最有效的培养方式。笔者就目前中国小麦幼胚组织培养研究现状,对品种、胚龄、培养基、外源激素、预处理、接种方式等研究现状进行了综述,目的是为了进一步建立和完善小麦幼胚再生体系和转化体系提高参考。     

农杆菌转化小麦幼胚获得转bar基因再生植株

用农杆菌转化小麦授粉10d后的幼胚，经5‰PPT筛选获得大量正常再生植株。PCR及PCR－Southern杂交检测证明其中23％（18株）再生苗为转化bar基因植株，这些植株可明显提高对basta的抗性。还总结了农杆菌转化小麦幼胚高效获得转基因再生植株的处理程序。     

小麦幼胚无性系麦谷蛋白亚基变异研究

对通过辐射诱获得的323个无性系进行了SDS－PAGE电泳分析，结果表明，小麦储藏蛋白变异几率随愈伤辐射剂量的增强而增加，但是随辐射剂量的增加，愈伤存活率，绿苗再生率了随这剧烈降低。同时分析了麦谷蛋白变异类型及其与植株形态变异的关系，提出了小麦幼胚愈伤组织辐射诱变的适宜剂量。     

小麦幼胚的脱分化状态及再生性能研究

通过对30个品种（系）的研究，确立了小麦幼胚最佳取材时期的种子形 态指标：在幼种子发育到嫩绿色，脊部由光亮转变为无光泽并具一层绒毛时，幼胚刚好发育到透明的后期和半透明前期。该时期仅有几个小时。探讨了不同基因型的幼胚的致密愈伤组织诱导状况及其继代保持和分化能力，并获得了良好的再生体系。使得致密愈伤组织诱导率达到91％，在14d时分化频率达到96．7％，70d时分化频率仍可达62％。并就温室材料和大田材料以及不同年份大田材料的致密愈伤组织的继代保持和分化能力进行了比较。     

小麦幼胚愈伤组织诱导影响因素的研究

小麦幼胚愈伤组织是目前小麦遗传转化中最常用的转化受体系统。以小麦幼胚为外植体,对愈伤组织诱导中的不同基因型、基本培养基、激素、碳源进行了研究。结果表明,不同基因型材料、不同基本培养基的幼胚愈伤组织诱导存在明显差异,其中西农1376和小偃22两个基因型小麦的组培特性较好,MS培养基适于作为小麦幼胚愈伤组织诱导的基本培养基。在MSD培养基中加入1.0mg/LABA或0.2mg/L6-BA能明显改善愈伤组织的生长状态,并以ABA的效果更为显著。将MSD培养基中的蔗糖浓度从30g/L降为15g/L,同时加入15g/L山梨醇,可显著提高愈伤组织的质量。选择适宜的基因型和合理的培养基构成是改良小麦幼胚愈伤组织诱导效果的关键。     

小麦芽生长点的基因枪转化技术研究

为建立简易的不依赖组织培养和抗性筛选的小麦转基因技术,以小麦品种石4185为对象,以gus和badh/bar为外源基因,围绕适于基因枪转化的种子芽生长点受体的制备、基因枪轰击参数的优化等开展了试验,建立了"用解剖刀去除种子根、用镊子把芽鞘掰去、用镊尖扫去包盖生长点的未展开叶、将带生长点的部分与胚乳分离"为特点的受体制备方法;确定1 100 Psi+9 cm为最佳轰击参数组合.对轰击后的小麦芽生长点(70个×3批)进行gus基因瞬时表达检测,以受体数统计时,转化率为22.9%～35.7%;以生长点数统计时,转化率为5.7%～8.6%.用含badh/bar的pABH9质粒转化1 000个受体,发育成了802个T_0植株,对T_0植株所结种子长成的穗行喷200 mg/kg的PPT进行抗性筛选,获得了105个抗性株,究其来源为42个T_0株,由此计算抗性率为5.2%.用PCR检测T_1植株,6个呈阳性.初步建立了基因枪法转化小麦种子芽生长点的技术.     

VB1和干燥处理对小麦幼胚愈伤组织培养的影响

以14个小麦品种为试验材料，研究不同浓度维生素B1和分化前的干燥处理对小麦幼胚愈伤组织诱导、分化过程的影响。结果表明，小麦幼胚愈伤组织的分化率在不同基因型之间差异显著，其中最高的为郑新992(71．9％)；在愈伤组织诱导、继代以及分化培养的Ms培养基中添加维生素B1(盐酸硫胺素)10mg／L有利于小麦幼胚胚性愈伤组织的发生，同时对促进小麦幼胚愈伤组织的分化也有显著影响；在转入分化培养基前对愈伤组织进行干燥处理(12h)可有效提高其分化频率。     

玉米自交系幼胚愈伤组织诱导的条件优化

本研究以铁7922、H99、丹598和丹988四个玉米自交系的幼胚为材料,对影响愈伤组织诱导和继代的几个重要因素进行研究。结果表明,2mg/L的2,4-D有利于胚性愈伤组织的形成,基因型、培养基、胚龄和4℃冷存时间对其也有明显影响。此外,添加KT、Ca2+和AgNO3,H99和丹988的胚性愈伤率明显提高,而铁7922的胚性愈伤率则有所下降。此外,Ca2+的添加对丹598的胚性愈伤率没有明显影响。     

基因枪轰击转化棉花茎尖分生组织影响因素的探讨

以农大KB18的茎尖分生组织为受体材料,利用基因枪轰击法将植酸酶基因(PhyA)导入棉花茎尖分生组织,经过再生、筛选、分子检测等过程获得若干转基因植株。通过研究碳源、外源激素、活性炭、轰击距离和轰击次数以及茎尖的恢复培养与抗性筛选等,建立了较为完善的棉花基因枪茎尖转化体系。结果表明,植株再生率与再生培养基的成分,如激素的有无、活性炭的含量和碳源等有关,轰击距离以及筛选程序中卡那霉素的起始筛选时间、筛选浓度和浓度梯度等因素对转化周期和转化率有直接影响。     

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪轰击转化的研究

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪遗传转化,在不受宿主基因型范围和操作时间的限制等方面优于农杆菌介导法和花粉管通道技术。影响棉花茎尖分生组织基因枪遗传转化率的因素较为复杂,轰击前,外植体制备需考虑茎尖分生组织的取材时间、下胚轴保留的长度、外源生长调节剂及活性炭的使用量,以保证其正常生长;轰击后,抗生素筛选的浓度、筛选培养基的转换时间和抗性苗的壮苗也会影响转化效率;此外,DNA和钨粉或金粉的质量、基因枪参数及操作等对转化效果都有一定的作用。除对影响茎尖分生组织基因枪转化率的因素分析以外,还对近年来在棉花茎尖分生组织遗传转化中的最新动态进行了综述,并对目前存在的问题加以讨论。     

甘啤4号大麦幼胚愈伤组织诱导及植株再生的研究

本研究以甘啤4号的幼胚为外植体材料,以模式品种Golden promise为对照,研究了不同培养基和激素配比对甘啤4号幼胚愈伤组织的诱导及植株再生的影响。研究结果表明,在同一培养基上,甘啤4号出愈率低于Golden promise,但都达到50%以上;在诱导愈伤组织的过程中,甘啤4号在IM2培养基上的出愈率较高,达71%,IM1与IM2培养基上形成的愈伤质量较IM3好,说明培养基对愈伤组织的出愈率起决定作用;且研究发现dicamba较2,4-D能提高大麦幼胚的出愈率。在相同的培养基上,Golden promise的诱导率明显高于甘啤4号,可见基因型对大麦愈伤组织的诱导率起决定作用。且不同的培养基和不同激素配比对幼胚愈伤组织的诱导率及分化率不同,分化培养基DM1的分化率高于DM2,这说明除基因型外,激素也对植株再生产生重要影响。研究证明甘啤4号愈伤组织诱导率及分化率均较高,适合于作为遗传转化的受体材料。     

基因枪介导的海岛棉(Gossypium barbadense L.)茎尖遗传转化体系的建立

以新疆海岛棉品种新海13号的茎尖为转化受体,采用基因枪介导法,研究DNA包裹浓度、微载体种类、前渗处理时间、轰击条件、筛选方法等对茎尖转化的影响,建立了基因枪法介导的海岛棉茎尖转化体系。研究结果表明,采用1.5μg·μL-1的质粒DNA包裹1.0μm金粉微载体,前渗处理12 h,轰击压力为7.584 MPa(1100 psi),轰击距离为6 cm,后渗处理16 h,恢复处理24 h,在120 mg·L-1卡那霉素浓度下直接筛选35 d。在添加4g·L-1活性炭粒的生根培养基中诱导抗性幼苗生根,获得抗性再生植株。通过PCR和RT-PCR检测,共得到5株转抗除草剂基因EPSPS的阳性植株。该研究体系的建立为海岛棉的遗传转化奠定了基础,为海岛棉的育种工作提供了材料。     

活性炭促进玉米幼胚离体培养幼苗生长与发育的转录组分析

以玉米自交系昌7-2为试材,比较了14 d龄幼胚在MS和MSA(MS加活性炭)培养基上离体培养9 d的幼苗生长情况,并利用转录组测序技术分析了2种培养基上的玉米幼苗地上部和地下部的基因表达差异。结果表明,活性炭可以显著促进玉米幼苗的生长与发育。活性炭主要影响地下部基因表达。加入活性炭后,幼苗地下部表达上调的基因有1612个,下调的基因有530个;幼苗地上部表达上调的基因有69个,下调的基因有78个。GO功能显著性分析表明,地下部差异表达基因(DEGs)主要涉及DNA包装、DNA包装复合体和水解酶活性,地上部DEGs主要涉及脂类代谢、胞外区和过氧化物酶活性。KEGG富集分析表明,地下部DEGs主要涉及能量、碳水化合物、脂类和氨基酸代谢,以及细胞周期和植物激素转导途径;地上部DEGs主要涉及泛醌和其他萜-醌类物质合成途径。活性炭促进细胞周期途径中的关键基因(CYC、CDH1、MCM3、PCNA2和BUBR1)、生长素信号传导基因(Aux/IAA)以及细胞色素基因(CYP450)显著上调表达。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证了10个DEGs的表达模式与转录组测序结果一致,证实了转录组数据与分析的可靠性。