苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

马尾松RCA基因的克隆和序列分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubis CO)活化酶(RCA)是体内活化光合作用限速酶—Rubis CO的重要酶。本研究通过反转录PCR和c DNA末端快速扩增技术,从马尾松中分离得到了Pmrca1(登录号KF420118)和Pmrca2(登录号KF420119)两条RCA基因c DNA序列。两条序列均包含完整的编码区与5'端和3'非翻译区,长度分别为1 816 bp和1 953 bp,编码Pm RCA1和Pm RCA2两个蛋白,长度分别为480和440个氨基酸。序列分析发现两个蛋白质都具有RCA和AAA+蛋白家族(ATPase associated with various cellular activities)特异性结构域和定位于叶绿体的转运肽,Pm RCA1还具有RCA大同工型特有的由两个半胱氨酸(Cys)残基组成的保守结构。多重序列比对显示,这两个蛋白质序列分别与红花槭的RCA大同工型和小同工型的相似性达到78%。将Pm RCA1和Pm RCA2与20种不同物种RCA构建进化树,发现其与地中海松属于同一分支。研究结果为进一步分析马尾松RCA的功能和光合作用机制奠定了基础。     

南荻纤维素合成酶CesA基因的生物信息学分析

于PacBioSMRT单分子实时测序技术进行3代转录组测序,辅以2代测序,构建出一个完整的,准确的南荻Unigene库.通过与近源物种比对后,拼接出南荻(Miscanthus lutarioriparius)纤维素合成酶基因(cellulose synthase gene)CesA4、CesA7和CesA9的序列,并将...     

西葫芦种皮纤维素合成酶基因CpCesA的克隆及表达分析

裸仁西葫芦因其种皮退化无需脱壳而备受关注,纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是影响西葫芦种皮形成的重要因素,而纤维素合成酶(CES)在植物纤维素合成过程中起关键作用。为深入探究西葫芦CpCesA基因对种皮形成的调控机制,本研究通过克隆获得CpCesA的基因序列,利用生物信息学方法分析其结构和编码蛋白的理化性质。利用实时荧光定量PCR检测种皮不同发育时期和西葫芦不同组织部位CpCesA的表达模式。通过克隆获得CpCesA开放阅读框序列全长2 952 bp,生物信息学分析表明,其编码的蛋白质在葫芦科作物中有很强的保守性,且具有纤维素合成酶家族蛋白的保守结构域,属于质膜蛋白。实时荧光定量PCR结果显示：在种子发育过程中,Cp Ces A在裸仁西葫芦种皮中的表达量比有壳西葫芦普遍显著偏低,有壳西葫芦在授粉后10 d CpCesA表达量达到最高,而裸仁西葫芦则在授粉后20 d达到最高后开始下降。不同品种种皮发育相同时期、同一品种不同发育时期Cp CesA表达量表现均不同,这表明CpCesA与西葫芦种皮的发育和形成有着密切关系。组织表达分析表明,Cp CesA在两种西葫芦叶片、茎、根、花瓣等不同组...     

马尾松PmTIR1基因的克隆及编码蛋白质的结构预测

TIR1(transport inhibitor response 1)基因在生长素信号转导途径中发挥重要作用。本研究采用PCR技术和RACE技术,利用Primer Premier5进行引物设计,从马尾松中克隆出TIR1基因的全长c DNA序列,命名为Pm TIR1。此c DNA全长2 446 bp,包括1 725 bp完整的ORF,能够编码含有574个氨基酸的蛋白,此蛋白相对分子质量为64 240.3 u,等电点为6.76。利用Clustal X、ANTHEPROT和DNAMAN等软件分析Pm TIR1序列及其编码的氨基酸序列,结果表明:马尾松Pm TIR1蛋白氨基酸序列与火距松TIR1蛋白同源性高达99%,Pm TIR1蛋白含有F-box结构域和多个LRR结构域;Pm TIR1蛋白的F-box结构域可能与SCFTIR1中SKP1结合,它符合F-box家族的特点。利用实时定量技术得知Pm TIR1在马尾松嫩根、嫩茎、嫩叶中都有表达,在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供理论依据。     

大青杨纤维素合酶PuCesA 7基因片段的克隆及序列分析

本研究以大青杨叶片总DNA为模板,用已登录的欧洲颤杨PtrCesA7保守序列设计引物,进行TD-PCR扩增并将得到的片段克隆到pMD18-T载体中。测序结果分析表明,片段长2341bp将该基因片段命名为PuCesA7。经BLASTX比对,此片段包含6个编码区,共1248bp,编码416个氨基酸。并与欧洲颤杨的PtrCesA7基因的同源性为98%,证明克隆的片段为纤维素合酶基因。将该片段与GenBank中登录的玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、欧洲颤杨(Populus tremuloides)、新西兰辐射松(Pinups radiata D.Don)同源纤维素合酶基因序列比对并进行进化树分析。结果表明,大青杨纤维素合酶基因片段均与它们的亲缘关系较远。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

植物纤维素合成酶基因的进化分析

从基因库中调取已完成测序的纤维素合成酶CesA(Cellulose synthase)基因序列和氨基酸序列,共涉及15个物种的89个基因,基于以上氨基酸序列,应用常用的系统发生关系树生成软件MEGA3.1,做出这89个基因的系统发生关系树。综合已知的模式植物CesA基因的功能(仅指初生壁或次生壁形成特异性),可推测某些未知功能基因的可能功能。研究还发现绿竹CesA基因与玉米和大麦CesA基因在系统发生关系和同源性方面关系密切。CesA一级结构可变区中半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等氨基酸的含量变化较大,在同一位点半胱氨酸多是与丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸发生相互替换。     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

马尾松幼苗PmMADS4基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因编码的转录因子,在植物、动物及微生物的发育过程中起着重要调控作用,本研究从马尾松幼苗转录组测序结果中筛选到1条具有完整开放阅读框的MADS-box基因序列,设计特异性引物并克隆获得该基因,通过生物信息学方法分析该基因的序列特征、编码蛋白的理化特性、结构域以及进化关系等,并应用荧光定量PCR技术分析该基因在马尾松幼苗不同组织中的表达活性。结果表明,克隆得到的MADS-box基因开放阅读框为672 bp,命名为Pm MADS4。Pm MADS4编码223个氨基酸,含有MADS保守域和K-box次级保守域。蛋白质理论分子量为24854.15 kD,理论等电点为7.83;其蛋白质结构主要由大量的α-螺旋(58.74%)和大量随机卷曲(31.84%)构成;亚细胞预测该基因主要在细胞核(43.5%)、线粒体(17.4%)、高尔基体(13.0%)和细胞质(13.0%)中发挥生物学作用。系统进化分析显示,Pm MADS4属于MADS-box家族基因中MIKC型的GMADS分支。组织特异性表达分析发现,Pm MADS4在马尾松幼苗的顶芽和茎中高表达,表达量分别是根部的239倍和123倍;在根部、初生叶和针叶中的表达量相对较低,表明Pm MADS4可能广泛参与马尾松幼苗地上部分分生组织的发育过程。本研究结果为Pm MADS4基因在马尾松幼苗生长发育调控方面的深入研究提供了数据基础。     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。     

绵羊Gastorkine-1基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了绵羊Gastorkine-1基因。提取皱胃黏膜组织总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆并测序。克隆的绵羊Gas-torkine-1基因长619 bp,编码185个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为82.0%,48.8%,85.4%,96.9%,推测的氨基酸序列信号肽为1~20 aa,BRICHOS结构域为54~150 aa,结构特征与人、小鼠、猪、牛的Gastorkine-1相一致。     

广藿香法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)的克隆及生物信息学分析

为进一步阐明广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)中百秋李醇(Patchouli alcohol)生物合成的分子调控机制,本研究采用RT-PCR技术从广藿香叶片中克隆得到法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase) FPS基因,并通过qRT-PCR技术分析FPS基因在广藿香幼苗期(扦插后60 d)与成熟期(扦插后240 d)叶片中的相对表达量。对克隆得到的广藿香FPS基因进行生物信息学分析,序列片段长为1 177 bp,其中包含1个长度为1 050 bp的开放阅读框,编码由349个氨基酸残基构成的蛋白质,与其它已知FPS氨基酸序列的唇形科植物一致性高达93.10%,与已知的米团花(Leucosceptrum canum Smith) FPS蛋白亲缘关系最近。预测FPS蛋白质分子质量约为40.09 kD,理论等电点(pI)为5.34,推测其为亲水性蛋白,无跨膜区且不含信号肽,属于类异戊二烯生物合成家族。qRT-PCR结果表明FPS基因在成熟期叶片中表达量高于幼苗期,与转录组数据分析结果一致。本研究结果为进一步研究FPS基因在广藿香中的应用,探究广藿香中百秋李醇生物合成途径中关键酶的表达模式及通过调控百秋李醇生物合成提高广藿香挥发油中有效成分含量提供了理论依据。     

芒果 ANS 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的cDNA长度为1252 bp,开放阅读框的长度为1056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。