RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明：以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究.结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA.设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带.构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%.用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据.     

应用RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草

RNA沉默是迄今最为有效的抗病毒策略,利用该策略不但能获得免疫转基因植株,且所得植株不易与其他病毒基因重组或异源包壳、生物安全性较高。将本实验室已构建的携带有烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因(ΔRep)反向重复结构的植物表达载体pBIN438-MP-Rep(i/r),用农杆菌浸润法转化普通烟草品种K326,共得196株转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测发现128株为阳性转基因株;PCR-Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到烟草基因组并在转录水平上得到表达;ELISA结果显示20.3%的转基因植株对CMV和TMV复合侵染表现免疫性。本结果为利用RNA沉默技术进行植物抗多种病毒育种提供重要数据,为防治其他多种病毒复合侵染提供借鉴。     

双重检测马铃薯X和Y病毒试纸条制备技术研究

为了实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X（PVX）和Y病毒（PVY）,利用胶体金标记和免疫层析技术研制了PVX-PVY双重检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,在波长526nm处有最大吸收值,金颗粒直径约25nm。同时标记PVX和PVY兔多克隆抗体,将抗体标记物喷射于玻璃纤维纸上,作为金标垫。将PVX和PVY抗体分别划线于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线,制备胶体金试纸条。结果表明,研制的双重试纸条能够在2min之内同时检出PVX和PVY。PVX病汁液检测稀释限度可达10⁶倍（W/V）,PVY可达10⁵倍（W/V）,其中对PVX检测更灵敏。用其他4种常见病毒（PVS、PLRV、PVA和PVM）检测,未出现交叉反应。在田间采集马铃薯叶片,分别利用试纸条与DAS-ELISA检测,结果一致性非常高。由此可知,该试纸条具有操作简便、反应快捷的特点,特别适用于田间及口岸一线对于马铃薯X和Y病毒的同时检测。     

烟草马铃薯Y病毒病的发生原因与防治对策

烟草马铃薯Y病毒病(PVY)近年来在安徽省的发生与危害日益严重,目前已成为安徽烟区最主要的病毒病.本文分析了安徽烟区近年来烟草马铃薯Y病毒病的发生特点及流行原因,并提出了相应的防治对策.     

感染病毒的烟草对烟蚜种群及蜜露排泄的影响

研究了感染CMV,PVY后的烟草对介体烟蚜的种群及蜜露排泄的影响。结果表明,PVY病株有助于介体烟蚜种群数量的增长;CMV病株在接蚜初期,不利于烟蚜若蚜的存活与发育,但到后期种群数量与健株之间无明显差异。24 h内,以PVY病株上烟蚜的蜜露排泄量最大,健株次之;CMV病株最少。     

水杨酸对烟草抗黄瓜花叶病毒的诱导效应

通过外源水杨酸（Salicylic acid,SA）处理烟苗,研究了水杨酸处理的烟草接种黄瓜花叶病毒后,其病情指数及抗病相关酶活性和H2O2含量的变化。结果表明：接种CMV后21d,SA处理烟株的病情指数显著低于对照;SA预处理的烟株在接种CMV前后叶片内的过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢（H2O2）含量提高,过氧化氢酶（CAT）活性下降。表明水杨酸具有诱导烟草抗黄瓜花叶病毒的效应。     

烟草CMV抗性鉴定及抗性基因的SSR标记研究

本研究以抗黄瓜花叶病毒病的烟草品种铁把子和台烟8号,感病品种NC82和中烟15为亲本,构建F1、F2、BC1代分离群体,并对它们进行CMV的接种鉴定和抗性遗传分析,结果表明铁把子和台烟8号对CMV的抗性是由1对隐性基因控制的.依据混合群体分组分析法(BSA),从F2代群体植株中选取DNA建立黄瓜花叶病毒病的抗病基因池和感病基因池,利用135对SSR引物进行分子标记和分析,得到标记SM1350与来源于铁把子的CMV抗性基因间的遗传距离为8.64 cM,标记SM2270与来源于台烟8号的CMV抗性基因间的遗传距离为3.92 cM.     

黄瓜花叶病毒番茄蕨叶分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析

在北京延庆的番茄上分离到1株黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物CMV-YQ,该分离物在番茄上造成严重的蕨叶、矮化,在烟草上表现花叶、矮化和畸形,表现出很强的致病性。根据黄瓜花叶病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术对其CP基因片段进行了扩增并克隆,获得了含该基因全长657 bp的cDNA片段。序列测定与比较分析结果表明,北京地区造成番茄蕨叶的CMV分离物CP基因片段核酸序列与GenBank上CMV亚组Ⅰ其他分离物同源性高达90%～99%,属于CMV亚组Ⅰ。该分离物与分离于我国芭蕉的另一亚组Ⅰ分离物GB同源性为94.37%,两分离物之间存在寄主适应性变异。     

TMV侵染烟草的早期响应蛋白分析

为了完善烟草花叶病的预警防控体系,分析烟草感染烟草普通花叶病毒后的蛋白质组早期变化,筛选烟草的早期响应蛋白。[方法]采用iTRAQ技术分析了蛋白质组变化,采用qPCR技术检测基因的表达。[结果]蛋白质组分析发现160个差异表达蛋白质,包括有64个上调表达蛋白和96个下调表达蛋白,这些差异表达蛋白质主要与氧化还原平衡调节、RNA降解、叶绿体组成及光合作用、逆境胁迫响应有关;qPCR结果显示这些差异蛋白质的mRNA表达变化趋势与iTRAQ数据基本一致;及时施用抗病毒药剂(氨基寡糖素和吗胍.乙酸铜)和植物诱抗剂(盐酸吗啉胍和氮苷吗啉胍)能够预防和控制烟草花叶病的发生,但同时发现PR10、LHCB、POD、HSP90、14-3-3和AGO1等蛋白的表达也受到了影响。[结论]试验筛选出一些TMV感染相关的烟草早期响应蛋白,不仅有助于阐述烟草花叶病发生的机制,也可用于筛选新的抗病毒药剂和植物诱抗剂。     

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病鉴定方法比较

便于年度间和研究者之间比较的抗病性鉴定方法,是筛选抗性稳定的抗病资源的基础。本文通过温室内人工接种,优化比较了烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病的抗性鉴定方法。病情指数、相对病情指数、相对抗性指数、病情发展曲线下面积四种评价方法的比较结果表明,相对病情指数可直观反映品种的抗性,便于年度间和研究者之间的结果比较。高压喷枪摩擦接种和蚜虫饲毒接种的鉴定结果基本一致。通过温室人工摩擦接种,筛选出高抗资源NC55和NC102、抗病资源VSCR和TI245,CV91和Oxford 207表现为中抗、台烟6号表现为中感、NC297和云烟97表现为感病、Coker176表现为高感。抗病亲本NC55、VSCR与感病优良亲本F1组合均表现感病或高感,表明NC55和Virginia SCR抗源的抗性为隐性遗传。     

Potato Virus Y Resistance Gene, Ry chc, Mapped to the Distal End of Potato Chromosome 9

Summary A Japanese leading cultivar ‘Konafubuki’ has an extreme resistance gene Ry _chc to Potato virus Y (PVY) in a simplex fashion. To reduce complexity of the highly heterozygous autotetraploid genome and map the Ry _chc gene, haploid plants were parthenogenetically induced from ‘Konafubuki’. The ratio of 7 resistant: 5 susceptible haploids confirmed the single dominant, simplex genotype of ‘Konafubuki’. A selected resistant haploid 98H20-5 was crossed with a susceptible diploid, resulting in 119 F ₁ plants. Using RFLP and RAPD markers, Ry _chc was mapped to the most distal end of the chromosome 9 where the recovery of recombinant genotypes was extremely reduced in this mapping population possibly due to the linked inferiority factor. The location of Ry _chc is different from those of the other extreme resistance genes to PVY, but possibly resides in one of resistance gene clusters.     

4种病毒抑制剂对昭通烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病的防治效果

番茄斑萎病毒病(Tomato spotted wilt virus, TSWV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是云南烟草生产上的主要病毒病,本研究旨在筛选有效的药剂防控烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病,从而减少烟草经济损失。通过小区试验,分别研究了1%香菇多糖水剂、3%超敏蛋白微粒剂、5%氨基寡糖素水剂和2%嘧肽霉素水剂对田间烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病的防治效果。结果表明：试验所选的4种病毒抑制剂对烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病均具有一定的防控作用,1%香菇多糖、3%超敏蛋白、5%氨基寡糖素和2%嘧肽霉素对烟草TSWV的防治效果分别为：31.11%~39.90%、54.34%~59.91%、8.69%~38.21%和22.75%~43.32%,4种药剂对烟草PVY的防治效果分别为55.08%~71.06%、68.10%~82.24%、37.76%~55.36%和58.07%~68.86%,其中,3%超敏蛋白的防效最好,其烟草TSWV和PVY防治效果分别高于50%和60%,其次是2%嘧肽霉素,对烟草TSWV和PVY防治效果分别高于22%和58%。防治烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病以3%超敏蛋白微粒剂的防治效果最佳,其次是2%嘧肽霉素水剂。     

贵州马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆与遗传分析

本研究从中国贵州不同海拔地区采集感染马铃薯Y病毒(PVY)病害叶片,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)方法克隆到长度为804 bp的8个目的片段,序列分析表明为PVY外壳蛋白(PVY-CP)基因.通过与已经发表的PVY-CP基因序列进行比较和遗传分析,并根据PVY的CP基因全长和5'端序列构建系统发育树,结果表明,本研究分离的PVY,7株为O株系,1株为NTN株系.