黄瓜果实CsEXP5基因片段的克隆与序列分析

以授粉后黄瓜幼果组织的总RNA为模板,利用简并引物,采用RT-PCR方法扩增出1条长度为480 bp的cD-NA片段。序列分析结果表明,该cDNA片段与来源于黄瓜根组织的CsEXP5片段序列(AF319471)同属一个基因,序列拼接后得到526 bp的cDNA序列。预测的CsEXP5蛋白具有一系列保守的Trp残基和HFD,KNFRV保守域。该蛋白属于α-扩张蛋白,与CsEXP10蛋白的同源性高达90%。该基因首次从黄瓜幼果中得以克隆,可能与黄瓜果实膨大生长有一定关系。     

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材,从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的cDNA序列,命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp,该序列具有完整的开放阅读框,位于31~1761bp,编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示,该蛋白在氨基端变化十分明显,中部较为保守,存在一个特征序列。系统进化分析表明,推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高,达到91.84%。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,随着果实成熟期的延长,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势,在转色期达到最大。在果实发育过程中,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。     

黄瓜CsamiR399b及其靶基因CsUBC24的生物信息学分析

为深入研究CsamiR399b对黄瓜果实膨大的影响,对CsamiR399b及其靶基因CsUBC24进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析了CsamiR399b的表达特性。结果发现,CsamiR399b前体序列含有完整的茎环结构; CsamiR399b在膨大的黄瓜果实中表达量高于开花当天子房和未膨大子房,证实其参与黄瓜果实膨大调控。对靶基因的生物信息学分析发现,CsUBC24蛋白二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,该蛋白质无信号肽及跨膜结构,定位于细胞核,为可溶性蛋白。系统进化树表明,黄瓜CsUBC24与甜瓜、南瓜和苦瓜等物种UBC24遗传距离较近;通过序列比对和保守域分析发现,各物种UBC24蛋白序列和功能结构域表现出较高的保守性,说明UBC蛋白功能保守。推测CsamiR399b通过调控CsUBC24基因表达参与了黄瓜果实膨大。     

黄瓜ABC转运蛋白基因(abca19)的克隆及其对农药霜霉威胁迫的响应

ABC转运蛋白基因与植物的多抗耐药性密切相关,是植物抗农药机理研究的热点。克隆黄瓜ABC转运蛋白基因abca19,分析其编码蛋白的氨基酸序列、理化性质和结构,了解其在霜霉威胁迫条件下的表达规律,为abca19的研究奠定基础,为黄瓜抗农药霜霉威机理研究积累材料。以D0351为材料,根据黄瓜基因组数据库中Csa7M368750.1基因编码区全序列,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,从黄瓜果实cDNA中克隆abca19基因的开放阅读框。定量PCR分析霜霉威胁迫处理条件下,黄瓜果实不同处理时间和黄瓜不同部位abca19的表达变化。abca19序列长度为921bp,注册到Gene Bank,登录号为KC123181。abca19编码306个氨基酸,与大豆(Glycine max)等植物abca19的同源性为80%。该蛋白是一个疏水蛋白,无跨膜结构,包含6个α-螺旋结构,无信号肽。具有蛋白激酶C磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、N-糖基化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点等多个活性位点。霜霉威处理条件下,0.5~6h黄瓜果实处理组abca19相对表达量极显著高于对照,9~48h对照组abca19相对表达量高于处理组,但二者间差异不显著。不同处理时间点(3、9和24h),叶片中abca19相对表达量最高,果实中其次,茎中最低。成功克隆到黄瓜abca19,该基因具有已知物种abca19的特征。霜霉威处理条件下,黄瓜果实abca19参与农药霜霉威胁迫响应,反应迅速且具有时限性。在黄瓜叶片和果实中,abca19积极参与对农药霜霉威胁迫的响应,茎中响应较弱。     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

黄瓜芽黄突变相关基因ClpP克隆及植物表达载体构建

为了获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,研究其与黄瓜芽黄突变现象的关系,本研究采用TRNzol法提取芽黄突变的黄瓜叶片总RNA,并以其为模板反转录合成cDNA第一链。根据NCBI预测的黄瓜ClpP基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到目的条带后测序,并构建植物表达载体;成功获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,并提交到NCBI。该基因编码区全长495 bp,共编码氨基酸158个。预测其理论等电点为5.22,理论蛋白质分子量为41.00356 KDa,编码的蛋白包含S14_ClpP_2保守结构域,无信号肽。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对发现与毛茛属植物的Clp蛋白酶同源性较高。并成功构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-ClpP。黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列的获得说明该基因在黄瓜中确实存在,这是首次克隆得到了黄瓜中的ClpP基因的cDNA全序列。     

黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1克隆及表达分析

中国黄瓜品种繁多，但黄瓜的抗逆性不强，容易产生病虫害。因此，分析和验证抗病相关的基因，探究黄瓜抗病的分子机理，可为培育黄瓜抗性品种提供理论基础。本研究以黄瓜为试验材料，采用RT-PCR技术克隆了黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1的cDNA序列全长，并对其进行生物信息学分析；采用荧光定量PCR的方法分析CsATX1基因在细菌性角斑病侵染0～96 h下的表达情况，以期探究其与黄瓜抗病性的关系。结果表明：CsATX1基因序列全长为768 bp，含有一个288 bp的ORF阅读框，可编码95个氨基酸，该基因编码蛋白的相对分子质量约为9.95 kD，理论等电点是5.07，为亲水性蛋白，不具有跨膜结构，不含信号肽序列。系统进化树分析表明Cs ATX1与葫芦科同源蛋白的亲缘关系最近。RT-qPCR分析表明，CsATX1在黄瓜叶中有表达，在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下，该基因在黄瓜叶中表达显著增高，受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导。该研究结果为深入探究CsATX1基因功能提供科学依据。     

花生DOFH10在细胞中可能通过小泡运输并在网格蛋白相关途径被专一地识别（英文）

为对花生未知的DOFH10基因进行研究,根据DOF转录调控因子DOF (DNA binding with One Finger)GW391728的c DNA序列,采用引物对s162-a1469和引物s30-a1469用PCR方法在花生16个品种中进行克隆比较,并进一步对DOFH10在数据库进行序列比对,对其一级结构酶切位点、三维空间结构、蛋白质表达等进行研究。结果表明,用引物对s162-a1469在5个品种中克隆得到2类DOFH10基因A和B类。它们分别与野生花生染色体A03上的XM_016100960. 2和野生花生染色体B03上的XM_016334585. 2序列完全相同。用引物s30-a1469从所有16个品种中得到相同的B类DOFH10基因,包括6个多粒果实品种。A类基因在4个多粒果实品种和1个2粒果实品种中存在。序列比对表明,A和B类DOFH10基因是不同基因编码的,它们分别位于家培花生的A和B基因组。B类DOFH10在DOF保守序列区域与野生花生染色体B01上编码网格蛋白集装相关蛋白XP_016199412. 2的一段基因剪辑后的RNA序列完全相同,DOFH10蛋白上多个肉豆蔻酰十四酰修饰位点的分布,这2个结果意味着该蛋白在细胞内的运输可能通过膜系统进行。蛋白质印迹分析表明,DOFH10在发育中子叶专一表达。花生DOFH10基因有A和B等2类,其中B类DOFH10存在于所有家培花生品种中,是必需基因,其蛋白可能通过Clathrin依赖的小泡运输途径运入细胞核。A类DOFH10更多存在于多粒家培花生品种中,可能与果实发育早期细胞分裂有关。     

黄瓜扩展蛋白基因家族的鉴定与生物信息学分析

扩展蛋白(expansins)是植物细胞壁的重要组成部分,能够引起细胞壁组分间松驰和细胞壁柔韧性增加,在植物的许多生长发育过程中发挥作用。为了揭示黄瓜扩展蛋白基因家族的功能,本研究利用全基因组测序数据鉴定黄瓜扩展蛋白基因家族,分析其结构特征及系统发育关系。黄瓜基因组测序数据分析显示,黄瓜扩展蛋白基因家族包含35个成员,包括A(21)、B(3)、LA(9)和LB(2)4个亚家族,分布在黄瓜7条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度范围为206-295,编码蛋白质具有保守的结构域,蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明,黄瓜扩展蛋白四个亚家族的平均内含子数目分别为A类1.8个,B类2.7个,LA类3.8个和LB类3.5个。基因表达分析发现,该家族基因在黄瓜雌雄花蕾及果实发育过程中表达丰度较高。本研究分析了黄瓜扩展蛋白基因家族的基本信息,可为深入研究其扩展蛋白基因的分子进化与生物学功能奠定基础。     

甜瓜黄瓜素基因启动子的序列及元件分析

本研究对甜瓜黄瓜素基因启动子进行了元件分析。讨论以采集的甜瓜叶片为试验材料,采用CTAB法提取植物DNA,并利用PCR扩增技术,成功获得了黄瓜素启动子的基因序列,利用DNAman、DNAstar等软件进行处理和分析序列结果,并采用Plant CARE和PLACE对启动子的元件进行生物信息学元件分析。分析结果表明:黄瓜素启动子与AY055805、LN713264、LN681897的同源性为100%、99%、99%。其序列含有多种高等植物果实启动子通用的顺式作用元件TATA-Box、CAAT-Box和光响应元件,同时部分序列还也参与了ABA、VP1反应和水杨酸反应。甜瓜黄瓜素启动子的研究为下一步利用该启动子进行深入的果实基因工程研究提供材料基础和理论依据。     

黄瓜果实苦味性状遗传分析与分子标记

本研究选用华南型果实苦味自交系D9320和欧洲温室型果实无苦味自交系D0432-3-4黄瓜为试验材料,构建6世代群体,进行果实苦味遗传规律分析;并对含有372个单株的F2群体进行SSR标记遗传连锁分析。研究结果表明:黄瓜果实苦味性状由单显性基因控制,有苦味对无苦味为显性,不同环境条件对该基因的表达会造成一定的影响;控制果实苦味的基因被定位于黄瓜第5号染色体(简称chr.5),该连锁群包含15个SSR标记,经D9320与D0708-2两亲本验证,这15对SSR引物均无多态性。与黄瓜果实苦味Bt基因最近的两侧翼标记为SSR12291和SSR02118,遗传距离分别为1.9 c M和1.8 c M,将Bt基因定位在黄瓜chr.5上3.7 c M范围内。     

黄瓜CsPYCR的克隆及生物信息学分析

本研究以黄瓜低霜霉威残留品系‘D0351’为材料,克隆了在霜霉威胁迫后上调表达的基因Cs PYCR,并采用生物信息学方法对该基因进行分析,以明确该基因在降低黄瓜果实内霜霉威残留过程中的作用机制,为下一步通过遗传转化试验鉴定基因功能提供理论基础。结果表明：该基因全长831 bp,编码276个氨基酸,属于PLN02688蛋白家族。该基因编码的蛋白质有可能为细胞质中的疏水蛋白质,无明显信号肽,无跨膜结构。与甜瓜(XM＿008457466.2)同源性较高。该基因启动子中包括与乙烯、脱落酸等激素相关的顺式作用元件以及防御和应激反应相关的顺式作用元件,且含有多个与逆境胁迫相关的MYB家族蛋白转录因子结合位点,推测其可能在降低黄瓜霜霉威农药残留过程中发挥重要作用。     

番木瓜成熟衰老蛋白基因CpSSA的克隆与表达分析

衰老相关蛋白(senescence-associated protein,SSA)基因在果实成熟衰老中起重要作用。为了探究番木瓜衰老相关蛋白基因,以‘大白八号’番木瓜果实为材料,采用RACE技术扩增出番木瓜SSA基因全长cDNA序列,命名为CpSSA(登录号:KX885408)。生物信息学分析显示,CpSSA全长1 203 bp,包含一个420 bp的开放性阅读框。番木瓜SSA蛋白含有139个氨基酸,分子质量为15.172 4 kD,等电点为9.61。该蛋白的氨基酸序列与桃、葡萄、杨树、菠菜的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树显示,番木瓜SSA与葡萄SSA表现出最小的进化距离,亲缘关系最接近。用荧光定量PCR分析在不同处理不同成熟度番木瓜果实中CpSSA基因的表达差异,结果显示在乙烯处理后的6 h和12 h表达量显著升高,在1-MCP处理中表达量较低,在乙烯/1-MCP处理果实中的表达模式与成熟衰老有一定相关性,推测CpSSA基因可能参与了番木瓜果实的成熟衰老进程。     

茄子(Solanum melongena)MADs-box家族基因SmA GL9的克隆与表达分析

本研究以茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2所构建的抑制差减文库(SSH)中差异表达的EST片段fan11为依据,利用RACE技术克隆得到一条与AGL9基因一致性达97.93%的cDNA序列,命名为SmA GL9。生物信息学分析表明,该基因有一个全长726 bp的开放阅读框,编码241个氨基酸,预测蛋白分子量为27.546 2 kD,理论等电点为9.00。保守结构域分析发现该蛋白含有MADS-MEF2-like和K-box两个保守结构域,属MADS-box转录因子。同源进化分析结果显示SmAGL9基因的蛋白质序列与辣椒AGL9基因同源关系相近。RT-qPCR分析表明,低温条件下SmAGL9基因在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,果实发育初期单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,推测SmAGL9基因在茄子单性结实子房和果实发育初期具有重要的调控作用。结果可为进一步研究茄子单性结实果实形成的分子机理提供参考。     

ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析

本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%.经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导.为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS基因5＇端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS.用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点.因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达.同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp.NCBI BLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%.将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础.     

黄瓜SUN家族的鉴定及其对逆境的响应

黄瓜(Cucumis sativus L.)是中国主要蔬菜作物之一,具有很高的经济价值。植物特有的IQ67结构域蛋白(SUN)家族成员是钙传感器的下游靶标,能够参与植物发育和基础防御反应。本研究通过黄瓜基因组新组装版本(v3.0),对黄瓜SUN基因家族成员进行了全基因组的鉴定和分析。结果表明,黄瓜SUN基因家族包含29个成员,编码的蛋白均含有保守的IQ67结构域。黄瓜SUN家族成员基因启动子区域含有多个响应激素和胁迫反应的顺式作用元件,通过分析公共已发表的转录组数据,本研究发现SUN家族基因可能在黄瓜果实生长发育及生物和非生物胁迫中起重要作用。研究结果为进一步了解SUN家族基因的功能提供了一定基础。     

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35～45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。     

鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长的克隆和生物信息学分析

为了从分子水平深入了解鸭梨多酚氧化酶结构特点,基于已知的鸭梨多酚氧化酶基因cDNA片段序列设计引物,以鸭梨果实总mRNA为模板,对该基因cDNA 5’端和3’端未知序列进行了RACE扩增,最终获得鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长序列。该序列长度为2126 bp,开放性读码框位于136~1917 bp之间,可编码593个氨基酸残基。对该基因所翻译的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明基因编码的多酚氧化酶属酪氨酸酶超级家族成员,三级空间结构为可溶性球状蛋白,不具备跨膜结构,在细胞中的定位应该位于类囊体腔中。这些生物信息的获得将为今后应用生物技术开展鸭梨多酚氧化酶的调控从而抑制鸭梨果实褐变提供十分重要的参考资料。     

粉蕉MbACS7基因的克隆及表达分析

乙烯合成及其效应是决定香蕉果实成熟的核心要素,其中1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)是乙烯合成途径的限速酶。粉蕉果实成熟速度较快,保鲜难度较大。研究粉蕉ACS家族基因的特征和表达模式可为控制香蕉果实成熟进程和延长货架期提供理论依据。本研究从粉蕉中克隆获得一个全长序列为1 458 bp的目的片段,编码485个氨基酸,分子量为54.751 kD,具有PLN02450保守结构域(37～1 377氨基酸),属于ACS基因家族蛋白,因此被命名为MbACS7。理化性质分析表明MbACS7蛋白亲水且不稳定。进化分析表明MbACS7蛋白预测的氨基酸序列与苦瓜(Momordica charantia) ACS蛋白的氨基酸序列(CAE53271.1)遗传关系较近。瞬时表达分析表明MbACS7蛋白在烟草表皮细胞的细胞核中强烈表达,表明该蛋白可能在细胞核中发挥着重要的生理功能。实时荧光定量表达分析表明MbACS7基因在粉蕉果实成熟期表达量最高,为果实发育初期的900多倍。本研究为进一步解析MbACS7基因在粉蕉果实乙烯生物合成中的功能奠定基础,也为改良香蕉果实贮藏性提供基因资源。     

黄瓜CsCCD7基因的核酸和蛋白质序列分析

为了研究CsCCD7蛋白的生物学功能并为CsCCD7的表达调控提供理论依据,使用一系列生物信息学软件、数据库和在线程序,对黄瓜CsCCD7核酸序列及蛋白序列进行分析。结果表明CsCCD7开放阅读框长1665 bp,编码554 AA,与CCD7蛋白同源性高;预测CsCCD7位于黄瓜第6号染色体上、基因全长含7个外显子和6个内含子。CsCCD7分子量是62.7 KDa、是不稳定蛋白;其蛋白序列中富含磷酸化位点;此蛋白为非分泌型蛋白、无跨膜结构域;预测其定位于叶绿体;此蛋白二级结构预测表明β折叠和β转角加起来的量多于α螺旋的量、为亲水性蛋白质;其二级结构和三级结构预测显示属于类胡萝卜素双加氧酶家族成员。CsCCD7属于CCDs蛋白家族成员、为黄瓜腋芽生长抑制基因的同源基因,可能在黄瓜腋芽生长和发育阶段对独角金内酯的合成和信号转导途径中起到重要作用,CsCCD7有进一步研究的价值。