酸柚硼毒害蛋白质双向电泳技术体系的优化

以硼毒害下酸柚实生苗的根和叶为试验材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、蛋白上样量、凝胶染色方法等条件进行了优化,建立了适用于柑橘蛋白质组研究的双向电泳技术体系。结果表明,使用改良后的酚抽法提取柑橘总蛋白效果较好,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数较多;当采用pH 4～7 IPG胶条、上样量为1.5 mg时,蛋白点分布广,点数最多;使用胶体考马斯亮蓝染色法,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。该体系为开展柑橘硼胁迫的蛋白质组学研究提供了技术基础。     

桃叶片总蛋白双向电泳技术的研究

采用改进的O'Farrell双向电泳系统,研究适于桃树叶片蛋白质组分析的双向电泳方法。通过对不同蛋白样品提取方法、不同pH梯度范围、不同上样量的比较,探索出一套适合桃树叶片总蛋白分析的双向电泳方法,即以TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白质样品,采用两性电解质配比pH3～10︰pH5～7为1∶4的IEF胶条,按90μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得背景清晰、重复性较好、蛋白分辨率高的双向电泳图谱。经此方法分离的桃叶片蛋白质经串联质谱分析(MS/MS)得到了较好的鉴定。     

枇杷叶片和果实总蛋白质提取及双向电泳的优化方法

以枇杷叶片和果实为材料,探索适于枇杷总蛋白质分析的双向电泳方法.比较2种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并对双向电泳蛋白质上样量、等电聚焦条件等进行了优化,探索出一种适于枇杷叶片和果实总蛋白质分析的高分辨率、高重复性双向电泳方法.采用酚抽法提取枇杷叶片和果实蛋白质,以24 cm、pH 4~7的IPG胶条,按15...     

番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立

通过对IPG胶条梯度、上样方式、上样量、聚焦条件等4方面条件的优化,建立了番茄子叶总蛋白双向电泳体系,即采用TCA丙酮沉淀法提取番茄子叶总蛋白,选用24 cm pH3-7NL的IPG胶条,采用水化上样,上样量300 μg,按聚焦程序Ⅰ或Ⅱ聚焦后进行双向电泳分离和银染染色。若采用制备胶,以获取高含量蛋白点,则将上样量提高至1.5 mg,按聚焦程序Ⅲ进行聚焦后进行双向分离,并采用胶体考马斯亮蓝染色。采用该优化的体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

葡萄种子蛋白质双向电泳体系的建立

为了进行葡萄种子蛋白质组学的研究,以葡萄种子为试材,通过对比粗蛋白质不同溶解方法、IPG胶条、上样量、等电聚焦参数以及不同SDS-PAGE分离胶浓度对双向电泳效果的影响,建立了适合葡萄种子的双向电泳体系。结果表明:TCA-丙酮提取蛋白质经酚抽提后蛋白质溶解快、杂质少、浓度高,筛选获得17cm pH 5~8的IPG胶条,上样量600μg,第一向的聚焦步骤达到80 000Vh以及11%的SDS-PAGE分离胶的双向电泳参数,蛋白质分离效果好。所建立的双向电泳体系,适用于不同葡萄品种的种子蛋白质分离。     

苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析

蛋白质提取方法和电泳条件的建立是蛋白质组学研究中双向电泳分析的关键。通过比较不同提取方法,包括酚/SDS抽提、TCA-丙酮沉淀法、甲醇/醋酸铵沉淀法以及改良HB-酚抽提方法。此外,还优化了样品上样量、等电聚焦程序设置等条件。从所得2-D图谱分离效果来看,改良HB-酚抽提方法所得蛋白点数最多,2-D图谱背景清晰、分离效果好,明显优于其他3种方法。300μg上样量可作为苹果叶片总蛋白2-DE分析的理想的上样量,同时优化了等电聚焦程序,最终得到的2-D图谱分离效果较为理想。该研究的开展也为苹果叶片蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

苹果果肉总蛋白提取及双向电泳分析

以苹果果肉为试材,通过比较总蛋白不同提取方法 (TCA-丙酮沉淀法、匀浆法以及改良酚抽提法),建立适于苹果果肉总蛋白提取技术。从所得双向电泳图谱分离效果来看,改良酚抽提法所得蛋白点个数最多、图谱背景清晰,分离效果好,明显优于TCA-丙酮沉淀法和匀浆法。同时,通过对各图谱分离效果的综合比较,认为在现有研究条件下,苹果果肉总蛋白双向电泳分析的理想上样量为250μg。     

观赏植物‘孩儿莲’及其近缘植物差异蛋白组的电泳分析

为探讨八角属植物结实性差异的分子机理,以‘孩儿莲’、‘杭州红茴香’及披针叶八角的幼叶为材料,在优化蛋白质双向电泳技术的基础上,就3种供试植物叶片蛋白质组的差异表达进行了分析。结果表明:在采用改良酚提取法、蛋白溶解液含0.25%IPG缓冲液、等点聚焦条件为50 000 V.Hr时,可以得到分离效果良好的双向电泳图谱。经2 DE Image Master软件分析,结果从‘孩儿莲’、‘杭州红茴香’和披针叶八角的电泳图谱上分别检测到6626、44和684个蛋白质斑点,说明在蛋白质分子水平上,‘杭州红茴香’与披针叶八角的亲缘关系较近,而与‘孩儿莲’的遗传差异较大。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

香蕉果实高质量总蛋白的提取方法

比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚抽法、丙酮沉淀法3种方法对香蕉(M.AAA Group Cavendish)果实总蛋白的提取效果。结果显示酚抽法所得图谱条带完整清晰;TCA法所得图谱条带间模糊不清,存在拖尾现象;而丙酮沉淀法提取的蛋白得率不高,蛋白带谱不完整。说明酚抽法适合香蕉果实总蛋白提取。同时为满足不同激素处理及采后不同成熟度香蕉果实高质量蛋白质提取的需要,在酚抽法基础上对提取缓冲液进行了改良,获得了良好的效果。为以后研究香蕉果实蛋白质功能奠定了基础。     

山葡萄花序蛋白质双向电泳技术体系的建立

【目的】为开展山葡萄花序蛋白质组学研究。【方法】以山葡萄(Vitis amurensis Rupr)花序为试材,通过对蛋白质提取方法、裂解液成分、胶条pH梯度的改进,建立了适于山葡萄花序蛋白质组学研究的最佳双向电泳技术体系。【结果】采用酚提取法提取花序蛋白质,用含有硫脲和DTT的裂解液Ⅱ裂解,选用17 cm pH 4～7的IPG胶条在适宜的双向电泳条件下分离,可以获得分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,可以检测出1 088个清晰的蛋白点。【结论】酚提取法适于山葡萄花序蛋白质的提取,硫脲和DTT可增强花序蛋白质的溶解性。     

橡胶树死皮病黄色体差异表达蛋白的初步分析

橡胶树"死皮病"给橡胶种植业带来严重的危害.为了更好地了解和阐明死皮病发生、发展的分子机制,研究应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophshiya/oresis,2-DE)比较橡胶树死皮株与健康株胶乳黄色体蛋白质组表达的差异.采用TCA/丙酮沉淀法提取橡胶树死皮株与健康株黄色体蛋白质并采用固相pH梯度(immobjlized pH graalient,IPG)双向凝胶电泳分离两种材料蛋白质,凝胶经银染显色后,用PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质.成功获得橡胶树死皮株与健康株胶乳黄色体的双向凝胶电泳图谱.鉴定出13个蛋白差异点,其中10个上调表达,3个下调表达.并应用质谱技术鉴定了其中部分表达差异的蛋白质点,对渗调蛋白进行功能分析,认为渗调蛋白在死皮株中表现下调的情形可能与死皮病的发生有一定的关系.     

地衣芽孢杆菌W10及其抗菌蛋白对桃褐腐病的抑制作用

地衣芽孢杆菌菌株W10菌液及其产生的抗菌蛋白对贮藏期桃褐腐病都有较好的抑制作用,高浓度（1 × 1010 cfu · mL-1菌液,3.0 mg · mL-1抗菌蛋白）效果更好。在较低温度（4 ℃）和湿度（RH70% ~ 75%）条件下,高浓度菌液和抗菌蛋白在病菌定殖前处理桃果能收到较好的防病效果。钙离子[0.1% Ca(NO3)2]能提高W10菌液及抗菌蛋白对桃果实褐腐病的防治效果,能明显推迟始病时间。W10菌液和抗菌蛋白浸果处理能显著降低贮藏期的自然腐烂率,与多菌灵效果类似;通过对果肉色差L*值、果实硬度、可溶性固形物含量、失重率等品质指标参数的测定,发现菌液和抗菌蛋白处理均不会影响果实品质。     

葡萄着色期果皮蛋白质组分析

为了研究葡萄不同着色期果皮中蛋白质表达特征,以着色初期、中期和后期等3个着色时期的葡萄果皮为研究对象,运用2-DE、MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术以及生物信息学方法对差异蛋白进行分析,结果表明:(1)双向凝胶电泳显示,果皮着色3个时期有1050个高度重复的蛋白点,差异显著的蛋白点有162个,其中108个蛋白得到鉴定,有87个蛋白映射到葡萄蛋白质组数据库中;3个时期均表达的差异蛋白有20个,且随着果皮颜色加深,差异蛋白数量呈上升趋势。(2)GO分析显示,ATP合成酶β亚基(ATPβ)极显著富集于磷酸核糖代谢过程,对着色初期果皮生理代谢的能量需求具有重要意义。(3)KEGG分析表明,碳代谢、生物固碳、磷酸戊糖、氨基酸生物合成等代谢通路在果皮着色的不同时期显著富集。(4)qRT-PCR分析显示,S–腺苷甲硫氨酸合成酶基因(VvMETK4)在果皮着色后期表达量最高。     

Comparative proteomic analysis of lens in congenital inherited cataract mice

AIM: To separate total lens proteins of congenital inherited cataract in mice and to observe the alteration of proteins after gene mutation.METHODS: We studied the mice with a spontaneous mutation of crystallin gamma S (Crygs) transmitted as a recessive trait. Total proteins were extracted and separated using immobilized pH gradient (IPG), two-dimensional electrophoresis (2-DE) and colloidal Coomassie brilliant blue (CBB) staining. The image analysis was carried out using PDQuest 7.30 software package. Several significantly differential proteins in gel were identified by matrix assisted laser adsorption/ionization-time of flight-tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS). RESULTS: As the 882 μg sample was added, we detected (417±53) spots and (370±41)spots in cataract and normal lens, respectively. As the 190 μg sample was loaded, we detected (60±7) spots and (57±5) spots in cataract and normal lens, respectively. Seven kinds of differential proteins were identified, including BFSP/filensin, γS, γF, βA1, βB1, βB2 and αB. In crystalline lens of mutant mice, γS and beaded-filament structure protein (BFSP/filensin) were not detected. γF was down-expressed (＜4 fold) while βA1, βB1, βB2 and αB were over-expressed (＞4 fold) in mutant cataract. The latter proteins were less MW than normal, suggesting that they were possibly truncated.CONCLUSION: 2-DE and mass spectrometry can help to assess and analyze the function of proteins as a novel approach. The mutant Crygs gene can lead to the abnormity of γS crystallin, which can induce the changes of skeletonal protein (BFSP/filensin) and other crystallins (γF, βA1, βB1, βB2 and αB), and then evoke cataract secondarily.     

葡萄叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

现对葡萄叶片中总蛋白质的双向电泳技术体系进行了初步探讨,比较了不同等电聚集程序、不同pH胶条以及不同SDS-PAGE凝胶浓度的双向电泳效果。结果表明:葡萄叶片蛋白质使用等电聚焦程序B、pH范围为4~7的胶条和12%的SDS-PAGE凝胶可以得到较为理想的双向电泳分析结果;采用7 cm胶条最大可以分离出143个有效蛋白质点。