利用PCR法从文库中快速克隆人促红细胞生成素基因

本文介绍一种利用ＰＣＲ技术从基因文库中快速克隆基因组ＤＮＡ的方法。含有１０７个克隆的人基因文库分成１０份，小量提取ＤＮＡ，利用特异性的寡核苷酸引物检测ＥＰＯ基因的存在与否。经过４轮ＰＣＲ筛选，从阳性管中取１０３个噬菌体进行铺板培养，经原位杂交获得含有ＥＰＯ基因的阳性克隆。阳性克隆的插入片段被亚克隆到质粒上。酶切分析及序列分析的结果均证明我们获得ＥＰＯ基因。ＰＣＲ－筛库法可以快速从文库中获得目的基因     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

人胎肝cDNA中EPO基因的克隆

从人胎肝中提取得总ｍＲＮＡ，然后通过ＲＴａｓｅ反转录得到ｃＤＮＡ，利用ＰＣＲ技术克隆到ＥＰＯ基因（全长为５２７ｂＰ），经过计算机分析已知ＥＰＯ基因保守区段的限制性内切酶位点，选择ＢｇｌⅠ和ＨｉｎｃⅡ进行酶解，确认所获得ＤＮＡ片段为ＥＰＯ基因。     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

易变山羊草中抗虫相关基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

易变山羊草是小麦近缘种植物，对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、根结线虫(Meloidogyne naasi)都具有很高的抗性。本实验根据小麦另一近缘种植物节节麦的抗虫基因Cre3保守区核苷酸序列设计合成正向引物，通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)从易变山羊草的RNA中扩增出抗虫相关基因部分cDNA片段。     

用一种改进的粘粒文库筛选方法克隆人α-乳清白蛋白基因

本文所介绍的粘粒文库筛选方法。是以ＰＣＲ技术为基础,并针对粘粒克隆扩增的不均一性而设计的。     

cDNA文库和PCR技术相结合的方法克隆目的基因

建立了一个以ＰＣＲ为基础,结合ｃＤＮＡ文库构建来克隆基因的方法。即通过寻找基因的保过区段,设计合成一对特异性引物。以双链ｃＮＡ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体连接物为模板,利用载体上的标准测序引物和基因的特异引物,ＰＣＲ扩增出包含ｃＤＮＡ两末端部分的基因。运用该方法我们克隆了稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因。与其它克隆方法相比,该方法不但稳定而且有快速与简便的优点。     

一个棉铃虫触角特异表达基因cDNA片段的克隆

摘要：昆虫触角嗅觉感器的主要功能是识别空气中的挥发性气味分子，它们直接与外界环境接触，外界环境中许多分子对昆虫细胞具有毒性，昆虫触角中必定存在某种机制分解这些毒性物质以及多余的气味刺激物。利用差异显示PCR的方法分离得到了3条棉铃虫(Helicoverpa armigera )触角专一性的mRNA片段，在GenBank中进行同源搜索表明，克隆A4-1与昆虫谷胱甘肽-S-转移酶基因家族具有很高的同源性。Northern杂交表明，克隆A4-1在棉铃虫触角中专一性表达，并且在雄蛾触角中的表达量明显比雌虫中高，这与棉铃虫性外激素结合蛋白基因的表达相似。根据该基因在昆虫触角中的表达情况以及已经报道的谷胱甘肽-S-转移酶在昆虫中所起的作用，推测该基因与性外激素的分解有关，同时可能参与触角中毒性分子的分解。     

桃脂氧合酶基因(LOX)家族cDNA全长克隆与序列分析

根据脂氧合酶保守序列设计的简并引物,从瑞蟠5号桃(Prunus persica cv ‘Rui pan 5')果肉总RNA中扩增出795 bp的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因的保守序列,并结合GenBank中公开的LOX基因的EST序列经Blast比对分析、序列组装之后设计基因特异引物(GSP).利用RACE技术共获得3条不同的桃LOX基因cDNA全长序列,分别命名为PpLox1～3(GenBank登录号:EU883638、FJ029110和FJ032015).序列分析结果表明,这3个桃LOX基因家族成员与其它植物的LOX基因尽管在核酸水平上的差异比较大.但在蛋白水平上却有较高的同源性.通过对桃LOX基因蛋白序列和其它植物LOX进行系统进化树分析,发现PpLox1属于13-LOX,PpLox2-3属于9-LOX.     

镉诱导的蚯蚓全长cDNA文库的构建与初步鉴定

采用人工土壤法，研究重金属镉(Cd2+)对成熟赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的急性毒性,表明蚯蚓对镉具有较强的耐受性。Trizol法提取蚯蚓RNA后，采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，成功构建了低剂量Cd2+（200 mg•kg-1）诱导的蚯蚓cDNA文库，其库容量为3.02×105 pfu/mL,扩增后滴度为8.67×109 pfu/mL，重组率为97.3％, 绝大多数的cDNA插入片段≥0•5 kb,平均长度≈1•0 kb。所够建的cDNA质粒文库容量及插入片段大小符合合格文库要求, 为进一步筛选蚯蚓体内解毒、免疫相关基因，寻找生物标志物奠定了基础。     

紫茎泽兰cDNA文库的构建及RuBP羧化酶基因的筛选

采用SMART技术首次构建了高质量的紫茎泽兰cDNA文库。经过涂平板测定和酶切反应鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×107 cfu/mL,重组率达98 %,插入片段平均大小在900 bp左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了1×1012,覆盖率达99 %以上。利用该文库筛选得到了紫茎泽兰核酮糖二磷酸羧化酶(RuBP羧化酶)cDNA片段。     

猪多潜能性维持因子5 cDNA全序列的克隆与分析

利用前期筛选出的一些与母猪妊娠相关的有价值的新候选基因,选取其中一个位于网络顶端的EST序列(CK455976),根据此EST序列设计引物,以母猪卵巢为材料提取总RNA,运用RT-PCR和RACE-PCR对其进行cDNA全序列克隆,得到多潜能性维持因子5(developmental pluripotency associated 5,DPPA5)基因cDNA全长596 bp,提交GenBank数据库,登录号为FJ436413.经序列分析发现,其中5'UTR长67 bp,3'UTR长175 bp,编码区长354 bp,编码117个氨基酸.同源性比对分析发现,该基因核苷酸序列与人、小鼠、猕猴和狗的DPPA5基因同源性分别为83%、70%、83%和80%;编码的氨基酸序列同源性分别为74%、55%、74%和69%.经生物信息学分析,预测出DPPA5的相对分子量约13.60 kD,等电点5.24,在约1～10、18～29、38～51、60～66和75～110位之间氨基酸存在亲水性区域,DPPA5蛋白主要存在于细胞膜外侧.