猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1．载体上，并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现，融合表达的rtGP5蛋白约42ku，将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析，证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5，按50pg／只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，经腹腔免疫BALB／c小鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原，通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测，筛选阳性克隆，结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现，获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型，且轻链均为k链。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5羧基端抗原表位的鉴定

为了鉴定和分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5羧基端的抗原表位，采用Goldkey软件分析PRRSV GP5羧基端抗原表位，经人工合成的方法获得编码GP5的部分基因，Eag Ⅰ酶切后插入经Eag Ⅰ线性化处理的噬菌体M13KE gⅢ克隆载体，转化至ER2738细胞，得到多株重组噬菌体，提取噬菌体的ssDNA进行PCR及序列鉴定，获得了展示GP5羧基端11个氨基酸的重组噬菌体，用PRRS阳性血清检测重组噬菌体，结果显示噬菌体展示的表位可被PRRSV感染血清所识别，从而证明GP5羧基末端的11个氨基酸是PRRSV的一个抗原表位。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒（pCI—GP5和pcDNA—U—GP5）分别肌肉注射免疫BALB／c小鼠，共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平，MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力，LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性，并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现，2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周，pCI—GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA—U—GP5质粒免疫组；而pcDNA—U—GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4%-CD8^＋T细胞比例明显高于pCI—GP5组。表明，GP5基因可诱导产生较高的免疫反应，泛素与GP5的融合表达可增强PRRSVGP5诱导的细胞免疫反应。     

PRRSV GP5抗原表位的串联表达及生物学活性鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白抗原表位在诊断和基因工程疫苗中的应用,本研究选取(PRRSV)GP5蛋白已鉴定的抗原表位(aa31³7和aa19237和aa192¹98)进行串联后克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli BL21后进行条件优化诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting结果表明,该重组目的蛋白(约31 000)得到分泌表达,且具有良好的免疫学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位研究进展

根据病毒表位与受体细胞结合部位的差异可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原表位的研究已有大量报道,论文根据PRRSV的基因组结构蛋白和非结构蛋白基因编码区特点,对鉴定的PRRSV相关抗原表位进行简要综述,为进一步开发PRRSV快速鉴别诊断方法和多表位疫苗奠定基础。     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的表达及其产物的纯化

对重组原核表达载体pETN的表达条件进行了优化，在最佳诱导条件下获得了猪生殖与呼吸综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)。利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行了纯化，再分别用SDS—PAGE电泳及Western—blotting试验对纯化产物的纯化效果及特异性进行了检测。结果表明，纯化产物的纯度可达95％以上，并具有良好的免疫学反应活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大.GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体.因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因.近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白B细胞抗原表位的鉴定

本研究去除了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株M蛋白基因部分疏水性区域后,克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1中进行表达,并利用表达的M蛋白(rtM)为抗原,免疫BALB/c小鼠制备了1株抗M蛋白的单克隆抗体(McAb)M283,IFA试验表明该McAb能够识别PRRSV CH-la株.同时将M蛋白基因进行一系列的氨基酸截短表达,证实M蛋白的117 aa～129 aa是McAb M283的抗原表位;对该抗原表位进行western blot 分析,结果显示该表位能被PRRSV感染猪的血清特异性识别.本研究结果为进一步深入了解M蛋白的抗原特性奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白分段表达及其生物学功能的鉴定

为进一步研究PRRSV GP5蛋白的生物学功能,本研究将已分离的PRRSV北美洲型野毒株TA-12的GP5基因分为4段(79 bp～207bp、133bp～330bp、229bp～492bp和382bp～603bp)分别克隆于pGEX-6p-1中,并转化E.coli BL21(Rosetta)细胞进行诱导表达.表达蛋白经纯化后,以间接荧光方法(IFA)检测它们与Marc-145细胞的相互作用.IFA检测结果表明GST-GP5-1和GST-GP5-2融合蛋白均能够与Marc-145细胞结合,而且其结合位点在27aa～110aa区域.本实验为进一步研究GP5蛋白生物学功能提供试验依据.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、M蛋白基因的克隆及其基因疫苗构建

参照GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型代表株VR2332 GP5和M蛋白基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV野毒株GP5和M蛋白基因603,525bp片段,并将其分别克隆到pMD18-T载体。测序正确后,将GP5和M蛋白基因分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,成功构建基因疫苗表达载体pEGP5-C1和pEM-C1。小鼠免疫试验证实,这些基因疫苗质粒可以诱导小鼠产生特异性抗体,并在二免后1周开始检测到特异性淋巴细胞增殖反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪IL-18基因共表达真核表达系统的建立

采用RT-PCR方法扩增了JL/07/SW毒株GP5蛋白和猪IL-18基因。将该基因克隆入真核表达载体pEG-FP-N1,获得重组质粒pEGFP-GP5和pEGFP-IL18-GP5。将重组质粒转染Marc-145细胞,通过Western blotting和green fluorescent检测产物的表达情况。结果显示,所构建的2个重组质粒在Marc-145细胞中能进行有效的转录。结果表明,所构建的重组质粒pEGFP-GP5和pEGFP-IL18-GP5在Marc-145细胞中得到表达,为进一步研究PRRSV基因工程疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用

从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体.重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法.利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P＞0.05).结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。