江苏部分地区猪高热病中猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测

猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因的保守序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为509 bp和372 bp的特异性基因片段,通过优化RT-PCR条件,分别对江苏不同地区送检的21份病死猪的血清、淋巴结、肺、肝、脾、心脏等组织进行单重RT-PCR检测.结果4份CSFV阳性,9份PRRSV阳性,其中3份CSFV和PRRSV同时为阳性.结果表明,CSFV和PRRSV单重RT-PCR诊断方法具有高度特异性,可用于临床诊断.     

复合RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立

为了快速准确地对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流感病毒(SIV)进行诊断与鉴别诊断,特进行试验。根据GenBank上已发表的PRRSV的ORF7基因序列、CSFV的C基因序列和SIV的M基因序列,设计合成了3对特异引物,开展RTPCR检测方法的研究。分别建立了PRRSV、CSFV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,并最终建立了PRRSV、CSFV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,可分别及同时扩增PRRSV 430 bp、CSFV 775 bp和SIV 225 bp的特异性片段。试验证明该方法适用于PRRSV、CSFV和SIV的诊断及鉴别诊断。     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示,该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明,该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp、430 bp和1 015 bp目的片段.以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR.CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性.以β-actin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%.同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒.结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测.     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

多重RT-PCR同时检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV方法的建立及其临床应用

根据猪瘟病毒（CSFV）P120基因及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）Nsp2基因缺失区两端的保守区分别设计合成1对特异性引物,建立了一种简便、快速、同时鉴别检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法扩增CSFV基因组时可获得508bp的片段,扩增PRRSV时可获得320bp的片段,扩增HP-PRRSV基因组时可获得230bp的片段,因此,根据多重RT-PCR产物大小可将三者区分开来。利用建立的多重RT-PCR方法,对50份临床可疑病料进行检测,结果发现,CSFV阳性率为8%,PRRSV阳性率为18%,HP-PRRSV阳性率为22%,而CSFV和HP-PRRSV混合感染阳性率达2%,PRRSV和HP-PRRSV混合感染阳性率达16%,说明所建立的多重RT-PCR方法简便、快速、特异,可同时鉴别CSFV、PRRSV及HP-PRRSV,亦可用于感染这3种病毒的临床病料的快速鉴定和分子流行病学调查。     

猪繁殖障碍性疫病多重PCR诊断方法的建立及其应用

根据GenBank已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的序列,经DNAstar生物学软件和BLAST序列分析,利用Oligo6.0软件分别设计并合成了4对特异性扩增引物.在初步优化单项PCR反应退火温度和反应体系的基础上,建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法.结果表明:该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性;对30份临床样品进行检测,结果发现,CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的阳性率分别为46.7%、43.3%、53.4%、10.0%,其中,PRV与PCV2、CSFV与PCV2和CSFV与PRRSV混合感染的阳性率分别为6.7%、36.7%和10.0%;PRV、PCV2和PRRSV单一感染的阳性率分别为3.3%、10.0%和33.3%.说明所建立的多重PCR诊断方法,可以应用于CSFV、PRRSV、PCV2和PRV混合感染所引起的猪繁殖障碍性疫病的临床鉴别诊断.     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

云南地区部分猪场猪呼吸道疾病综合症（PRDC）患病猪群中PRRSV，PCV-2，CSFV，PRV混合感染调查

 针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型PCV-2特异抗体。结果表明：各季节和不同生长阶段猪群存在一种及两种以上的病毒混合感染,四重感染相对较少。从全年看单独感染占39.10%,PCV-2感染率最高,其次是PRV,PRRSV和CSFV;二重感染占26.13%,以PCV-2+PRV最常见,其次是PCV-2+ PRRSV、PRV+PRRSV;三重感染占8.05%,PCV-2+ PRRSV+PRV最常见;有四重感染出现,仅占1.57%。从季节来看,春季和夏季混合感染最高,分别为76.53%和60.74%,冬季和秋季的混合感染率分别为59.50%和53.55%。从年龄和性别看,育肥猪的混合感染率高于仔猪,分别为68.66%和61.11%,种公猪的感染率高于母猪,分别为70.00%和55.51%。说明4种病毒有单独感染或混合感染,推测其中PCV-2在混合感染中可能充当免疫抑制的角色,混合感染使PRDC症状更明显,死亡率增高。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。