斑马鱼个体发育过程中的溶菌酶表达模式及其对LPS处理的应答

收集斑马鱼成鱼和不同发育阶段幼鱼,用LPS处理后提取总RNA,经反转录制备cDNA并检测溶菌酶的基因表达水平,利用实时定量PCR技术研究了斑马鱼个体发育过程中溶菌酶的表达模式及其对LPS处理的应答方式.结果表明:成鱼体内溶菌酶基因表达水平显著高于各发育阶段幼鱼,而且LPS处理成鱼后溶菌酶表达水平呈现出先降低后升高的应答模式.在对照组幼鱼的不同发育阶段,溶菌酶基因表达水平变化不大.在个体发育早期(3d和7d),LPS处理可引起溶菌酶表达水平持续降低.14d和21d幼鱼中溶菌酶表达水平都在LPS处理后3h开始降低,并在6h开始回升,其中21d幼鱼回升到显著高于对照组的水平,表明溶菌酶已表现出对外界刺激作出有效应答的能力.另外,28d幼鱼受LPS处理后溶菌酶基因表达的变化趋势与成鱼相似,均为先降低后升高.以上结果说明,溶菌酶在斑马鱼个体发育到21d时可对外界刺激作出有效应答,在28d时则可能发育成熟.     

溴鼠灵对斑马鱼的急性毒性效应研究

[目的]研究溴鼠灵对斑马鱼的生态毒性效应。[方法]在2 h内将受精后6 d的斑马鱼幼鱼暴露在不同浓度的溴鼠灵溶液中,计算溴鼠灵对斑马鱼幼鱼的半数致死浓度,并记录染毒后斑马鱼的运动轨迹。[结果] 2 h内溴鼠灵对斑马鱼幼鱼的半数致死浓度(LC₅₀)可达13.51 mg/L,表明溴鼠灵对斑马鱼幼鱼具有显著的急性毒性作用。光暗交替环境刺激下,随着溴鼠灵浓度的升高,对斑马鱼幼鱼的平均运动速度、加速度的抑制作用愈加显著。当药物浓度低于1.00 mg/L时,各试验组斑马鱼幼鱼的运动行为均未出现异常,当试验进行至60 min,10.00、50.00和100.00 mg/L浓度组斑马鱼幼鱼的运动能力显著下降。随着药物浓度的升高,斑马鱼幼鱼对强光刺激的应激反应受到显著抑制,100.00 mg/L浓度组斑马鱼幼鱼基本失去应激能力。[结论]溴鼠灵在2 h内对斑马鱼幼鱼具有显著的急性毒性作用,能够显著抑制其运动行为。     

罗非鱼与斑马鱼幼鱼肠内植物乳杆菌代谢比较研究

为比较外源添加植物乳杆菌在罗非鱼、斑马鱼幼鱼肠内的代谢情况,用104cfu/m L、105cfu/m L、106cfu/m L及107cfu/m L 4个浓度植物乳杆菌JCM1149分别浸浴罗非鱼、斑马鱼幼鱼3 d后取全肠,另外用107cfu/m L植物乳杆菌JCM1149分别浸浴罗非鱼、斑马鱼幼鱼7 d,在浸浴结束后0 h、4 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4d、5 d取全肠。将各肠道样本匀浆处理涂板计数,比较罗非鱼与斑马鱼幼鱼肠内植物乳杆菌的代谢情况。结果显示,浸浴3 d后,对比不同浓度下肠内植物乳杆菌绝对丰度变化,当浓度大于105cfu/m L,罗非鱼肠内植物乳杆菌绝对丰度无显著性差异,然而,斑马鱼肠内植物乳杆菌绝对丰度随浸浴浓度增加而显著升高(P0.05);以107cfu/m L浸浴7 d后,罗非鱼与斑马鱼肠内植物乳杆菌均显著降低(P0.01),其中斑马鱼表现更为迅猛,24 h时降低2个数量级,罗非鱼则只降低1个数量级。上述结果表明,植物乳杆菌鱼类肠内代谢存在明显的宿主差异性。     

莠去津对斑马鱼胚胎发育及幼鱼成活的影响

[目的]确定莠去津对斑马鱼生殖发育的毒性。[方法]从购自市场的斑马鱼中选取健康的雌鱼和雄鱼按1：2～1：3的比例进行交配产卵,分别用不同浓度的莠去津对斑马受精卵和平游后的幼鱼进行染毒试验,统计其孵化数和畸形数以及幼鱼死亡数。[结果]斑马鱼胚胎和幼鱼时莠去津毒性作用均很敏感,随着莠去津浓度的增加,斑马鱼胚胎孵化率降低,畸形率增加,幼鱼致死率增大。当莠去津高于30mg/L时,斑马鱼胚胎致死率和畸形率增加,当莠去津为50mg／L时胚胎出现全致死效应。斑马幼鱼对莠去津的毒性也很敏感,24h和48h的LC50值分别为36．25和22．89mg／L,在莠去津为50mg／L48h条件下,幼鱼产生全致死效应。[结论]该研究为莠去津的安全使用及淡水鱼的保护提供科学依据。     

毒死蜱对斑马鱼血清CAT和SOD活性的影响

通过对斑马鱼肌肉注射不同浓度(2、20、200、2000μg/kg)的毒死蜱,研究了斑马鱼血清中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化情况。结果显示:在处理后24 h两种酶的活性均明显升高;在处理后96 h两种酶的活性均显著下降。说明毒死蜱对斑马鱼机体的抗氧化系统有明显的损伤作用。     

毒死蜱对斑马鱼血清CAT和SOD活性的影响

通过对斑马鱼肌肉注射不同浓度(2、20、200、2000μg/kg)的毒死蜱,研究了斑马鱼血清中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化情况。结果显示:在处理后24 h两种酶的活性均明显升高;在处理后96 h两种酶的活性均显著下降。说明毒死蜱对斑马鱼机体的抗氧化系统有明显的损伤作用。     

利用转基因斑马鱼快速检测水体抗生素污染

将转基因斑马鱼Tg(CYP1A:GFP)和Tg(Flk1:EGFP)暴露于不同浓度的3种抗生素(盐酸庆大霉素、硫酸硫酸卡那霉素、盐酸万古霉素)中24 h,观察其荧光变化。结果表明,以ABIX野生型斑马鱼胚胎进行毒性试验,药物暴露24 h后盐酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素的最高合理浓度分别为120、150、240μg/mL。3种抗生素对CYP1A转基因斑马鱼幼鱼药物暴露24 h后,盐酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素分别在2、4、0.4μg/mL时开始出现荧光。而与对照(0μg/mL盐酸万古霉素)相比,Flk1转基因斑马鱼胚胎只有当240μg/mL盐酸万古霉素的高浓度暴露下才会出现血管被显著抑制的效果(P0.05)。综上所述,Flk1对这3种药物的敏感度过低,不适合用于这3种抗生素污染的检测,而CYP1A转基因斑马鱼幼鱼对这3种抗生素的敏感度都很高,可以作为这些抗生素污染的生物监测手段,这进一步开发了转基因斑马鱼在水环境检测氨基糖苷类和糖肽类抗生素污染中的应用。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因表达的实时定量PCR分析（摘要）

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]采用Trizol法分别提取12、24、48、72和96h斑马鱼胚胎和仔鱼总RNA;再使用MMLV反转录酶将其反转录为cDNA;合成的cDNA用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR-2基因的表达。实时定量RT-PCR扩增反应结束后,利用熔解曲线对扩增产物进行特异性分析。采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR-2基因表达量在12～72h呈上升趋势,在96h时有所下降。12h相对表达量最低,与其他发育期差异极显著（P〈0.01）,72h相对表达量最高,与12、24和96h差异极显著（P〈0.01）,与48h差异显著（P〈0.05）。[结论]斑马鱼血管发育至72h达成熟阶段,血管发育成熟前,VEGFR-2基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR-2基因表达水平下降。     

Cas9-CRISPR敲除hae3基因对斑马鱼血红蛋白生成的影响

为获得hae3基因缺失的突变体,并研究hae3基因对血红蛋白生成的影响,以斑马鱼Danio rerio为研究对象,利用Cas9-CRISPR技术,成功建立了缺失血红蛋白hae3基因的鱼类模型,采用显微注射技术将hae3 sgRNA与Cas9 RNA混合后对斑马鱼第一细胞期受精卵动物极进行注射,利用序列测定与比对、T7核酸酶酶切方法成功检测到了hae3基因的敲除,并对缺失hae3基因的斑马鱼和对照组斑马鱼同时进行固蓝(O-dianisidine)染色。结果表明,与对照组相比,试验组斑马鱼血红蛋白含量明显下降,并有畸形表型。研究表明,胚胎时期hae3基因的缺失会严重影响斑马鱼血红蛋白的生成,而且伴随畸形发育表型。     

Eya1-Six1信号在斑马鱼侧线神经丘毛细胞再生过程中的表达

机械感觉毛细胞对于脊椎动物的听力和平衡能力至关重要,低等脊椎动物毛细胞在遭受损伤后具有很强的再生能力。鱼类侧线神经丘毛细胞与内耳毛细胞具有相似的结构、功能、发育和再生过程。我们将受精后5~6 d的斑马鱼仔鱼置于400 μmol/L新霉素溶液中处理1 h破坏神经丘毛细胞。分别对处理后2、4、8、12及24 h的斑马鱼仔鱼进行组织学切片及功能基因eya1和six1b的整体原位杂交。组织学切片结果显示：对照组神经丘毛细胞与支持细胞形态及排布都很规则,毛细胞和支持细胞分别位于上层和下层;处理后2~4 h,上层毛细胞数量显著下降;处理后8~12 h,支持细胞和毛细胞之间界限模糊,部分支持细胞变长,且与基膜脱离;处理后24 h,部分神经丘内毛细胞及支持细胞数量、形态及排布接近对照组水平。整体原位杂交结果显示：eya1和six1b在对照组斑马鱼仔鱼整个神经丘都有表达;处理后4 h内神经丘中央毛细胞中eya1和six1b的表达量显著下降,周围的支持细胞中仍保持一定量的表达;这两个基因的表达量从处理后8 h起逐渐提高,在处理后12~24 h恢复甚至超过对照组。综上结果表明：神经丘毛细胞再生过程中可能有支持细胞的参与,且重启了神经丘毛细胞发育过程中的功能基因eya1和six1b。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

BDE-47对斑马鱼胚胎氧化应激与DNA损伤的毒性研究

以斑马鱼胚胎为受试对象,研究了2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)对胚胎的氧化应激及DNA损伤。通过对不同浓度BDE-47(1、5、10、50μg·L~(-1))暴露5 d后胚胎/幼鱼体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S转移酶(GSH)的活性及丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量变化的分析以及Sod1、Ucp-2、Gstp2及Nqo1基因相对量表达的测定,考查BDE-47对斑马鱼胚胎/幼鱼的氧化应激效应;通过单细胞凝胶电泳(SCGE)对尾矩值的分析,探讨BDE-47对斑马鱼胚胎/幼鱼的DNA损伤。结果显示,BDE-47能够显著诱导ROS与MDA的产生,并呈现浓度效应依赖关系;50μg·L~(-1)BDE-47能够显著增加SOD与CAT的活性,降低GSH的浓度。BDE-47暴露后50μg·L~(-1)暴露组基因Ucp-2的表达显著上调4.12倍(p0.01),Gstp2与Nqo1表达分别显著下调至对照组的0.62倍与0.55倍(p0.01),而基因Sod1相对表达量没有显著变化。同时,5、10、50μg·L~(-1)暴露组胚胎/幼鱼尾矩值显著增加并伴随着ROS的浓度升高。结果表明,BDE-47能够诱导斑马鱼胚胎/幼鱼产生氧化应激,ROS是诱发胚胎发生DNA损伤的导火索。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2基因表达的实时定量PCR分析

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR2-）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]分别从12、24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎和仔鱼中提取总RNA,用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR2-基因表达,采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR2-基因表达量在12-72 h呈上升趋势,在96 h有所下降。12 h表达量最低,72 h表达量最高,与其他发育期均有显著差异。[结论]斑马鱼血管发育至72 h达成熟阶段。血管发育成熟前,VEGFR2-基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR2-基因表达水平下降。     

盐度突变对黄条鰤幼鱼渗透调节功能的影响

为探讨盐度突变对黄条鰤Seriola aureovittata幼鱼渗透调节功能的影响,试验设计了35、29(对照)、15、10、5、0共6个盐度组,分别将体质量为80～120 g的黄条鰤幼鱼放入不同盐度下进行120 h的盐度突变试验,分别在试验的6、12、24、48、72、96、120 h对黄条鰤幼鱼鳃丝中Na~+/K~+-ATP酶活力,尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-含量,以及尿和血浆渗透压的变化进行测定分析,并观察了盐度急性处理对黄条鰤幼鱼存活和渗透相关组织结构的影响。结果表明:盐度0条件下,黄条鰤在25 min时出现部分死亡, 50 min时全部死亡,其他各盐度组未出现死亡;盐度5、10、15试验组随着处理时间的延长,黄条鰤鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力逐渐降低,总体上与对照组有显著性差异(P0.05),盐度35组随着处理时间的延长,鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力呈先上升后降低的趋势, 96 h后保持稳定且与48 h时无显著性差异(P0.05),各盐度组鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力在72 h或96 h后根据盐度的不同呈现"U"形分布;从尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-浓度变化看,盐度5、10、15组,在6～72 h内各离子浓度持续降低,整体上与对照组有显著性差异(P0.05),并在96 h达到最低值后保持稳定,盐度35组随处理时间的延长各离子浓度均上升,在120 h达到峰值;从渗透压的变化看,盐度5、10和15组中尿和血浆渗透压随盐度降低和处理时间的延长显著降低(P0.05),而盐度35组尿和血浆渗透压随处理时间的延长而显著升高(P0.05),渗透压在72 h后开始趋于稳定,在各处理时间点上均显著高于对照组(P0.05);即在低盐度(5、10、15)下,随着时间的延长鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力,尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-浓度,以及尿和血浆的渗透压均持续下降,上述大部分测定指标均在96 h后趋于稳定,而在高盐度(35)下各项指标总体呈上升的趋势;扫描电镜观察显示,与对照组相比,盐度5处理组的幼鱼鳃丝根部弯曲、小片粘连表面褶皱增多,皮肤分泌大量黏液物质,肾脏表皮露出大量颗粒状物质,而盐度35处理组损伤较轻。研究表明,黄条鰤幼鱼对盐度变化有较强的渗透调节能力,通过改变体液中离子含量及鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力来调节渗透压以适应环境盐度的变化。     

维生素E对毒死蜱胁迫下斑马鱼血清CAT和SOD的保护作用

通过对斑马鱼肌肉注射不同浓度毒死蜱以及维生素E,研究斑马鱼血清中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活力变化情况以及维生素E的抗氧化作用。试验分为5组,依次为对照组和低、中、高浓度毒死蜱组(0.002、0.02、0.2 mg/kg)以及高浓度联合维生素E(0.2 mg/kg+VE)治疗组。结果表明,毒死蜱不同浓度组短时间(24 h)作用均使两种酶活性升高(P﹤0.01),加维生素E组活性增高更显著;长时间(168 h)作用则明显抑制酶活性(P﹤0.01),维生素E组酶活性变化较平缓。表明毒死蜱对斑马鱼机体抗氧化系统损伤作用明显,维生素E对CAT和SOD活力有保护作用。     

低氧对斑马鱼细胞存活能力的影响

[目的]明确低氧对斑马鱼细胞存活和抗氧化酶系统的影响,为揭示鱼类细胞低氧适应机理打下基础.[方法]采用不同浓度低氧处理斑马鱼胚胎上皮细胞(ZF-4细胞),检测低氧对其存活率的影响,并分析低氧应激下ZF-4细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合酶(NOS)活性及丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量的变化.[结果]1.0%O2处理可促进ZF-4细胞存活;SOD活性呈先降低后升高的变化趋势,在处理24 h时达最高值;CAT活性呈先降低后升高再降低的波动变化趋势,于处理8 h时达最低值;GSH活性在处理16 h时达最高值,随后开始下降;MDA含量与对照组无显著差异(P>0.05);NO含量和NOS活性在处理16 h时达最高值.经0.1%O2处理8 h后ZF-4细胞的存活率达最高值;SOD活性在处理24 h时显著高于对照组(P<0.05,下同);经0.1%O2处理后CAT活性极显著降低(P<0.01,下同),GSH活性则从处理8 h后极显著高于对照组;MDA含量显著或极显著降低;NO含量和NOS活性极显著降低.[结论]在极端缺氧环境下,斑马鱼细胞主要通过提高SOD和GSH等抗氧化酶活性以提高细胞的低氧适应能力,从而促进细胞存活.     

黄河鲤谷胱甘肽对氨氮胁迫的生理响应

[目的]研究氨氮对鲤幼鱼肝组织谷胱甘肽及其酶系的影响,阐析谷胱甘肽对环境胁迫的抗氧化防御机理.[方法]将黄河鲤在对照组(0 mg/L)和低(10 mg/L)、中(20 mg/L)、高(30 mg/L)3个氨氮处理组中染毒,研究氨氮胁迫6、24和48h后对肝组织中谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转移酶(GST)活性的影响.[结果]氨氮胁迫诱导黄河鲤幼鱼肝组织中GSH含量、GSH-Px和GST活性迅速升高,并在氨氮胁迫24h达到最大值,从而抵御氨氮造成的氧化胁迫.随着氨氮胁迫时间的延长,肝组织中GSH含量、GSH-Px和GST活性降低,抗氧化能力减弱.[结论]氨氮胁迫诱导黄河鲤幼鱼肝组织中谷胱甘肽含量及其酶系活性改变,以有效清除细胞中的活性氧和有毒代谢物,提高鱼类对环境的适应性.     

莠去津和芴对斑马鱼胚胎的联合毒性效应研究

为了研究莠去津和芴的联合毒性效应,以斑马鱼作为模式生物,进行胚胎发育暴露实验、联合毒性模型预测和靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明,在联合暴露120 h后的斑马鱼仔鱼中均观察到异常发育情况,会引起斑马鱼胚胎卵黄囊异常和脊柱弯曲,其毒性作用方式分别为拮抗作用和协同作用,且无论低高剂量下,二元联合暴露比单一暴露时毒性风险更高。靶向代谢组学研究发现,污染物主要通过干扰甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸代谢等途径影响斑马鱼仔鱼的氨基酸代谢。研究表明,莠去津和芴的联合暴露对斑马鱼胚胎的神经发育、氧化应激、抗炎机制、能量代谢、免疫和细胞凋亡机制等生理功能可能产生影响,进而影响其生长发育,且卵黄囊异常是较为敏感的毒性指标。     

3种三唑类杀菌剂对斑马鱼的毒性研究

探究戊唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑3种三唑类杀菌剂对斑马鱼的急性毒性、两两等毒性和等浓度配比时对斑马鱼的联合毒性。同时,通过6 d胚胎发育试验,研究3种三唑类杀菌剂对斑马鱼胚胎的发育毒性。研究显示,戊唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑3种三唑类杀菌剂对斑马鱼胚胎、仔鱼和成鱼的急性毒性为中毒,苯醚甲环唑和丙环唑在等毒性和等浓度配比下对斑马鱼胚胎和仔鱼阶段为协同作用,其余组合对斑马鱼胚胎和仔鱼阶段为拮抗作用。发育毒性试验结果表示,3种三唑类杀菌剂对早期生命阶段毒性更强,可诱导斑马鱼胚胎、仔鱼出现一系列不良症状,包括孵化率下降、心率异常、生长抑制等。     

大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性研究

通过设置盐度的突变和渐变实验研究了大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性.结果表明：在盐度突变实验中,将大黄鱼幼鱼直接从海水（盐度27.2）移入盐度为3～24的水中,72 h内不会导致明显死亡;从海水移入盐度为2的水中,72 h的存活率可达72%;从海水移入盐度为1的水中,3 h后开始出现死亡,24 h内大部分死亡;从海水移入淡水中,6 h内全部死亡.在盐度渐变实验中,将大黄鱼幼鱼从海水直接移入盐度为6的水中后,再以不同的幅度降低盐度,在盐度高于3时,大黄鱼幼鱼的死亡率与相应盐度的突变实验相比无明显差异;在盐度低于2时,大黄鱼幼鱼的死亡率低于相应盐度的突变实验的结果.研究表明,大黄鱼幼鱼具有较高的低盐度耐受力.