紫花苜蓿响应低温胁迫转录因子的鉴定及表达分析

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表达不同。本研究有助于在整体水平加深了解紫花苜蓿转录因子表达特性,为进一步研究这些响应低温胁迫的转录因子的功能提供参考。     

扁蓿豆SK2型脱水素基因MrDHN3的异源表达提高大肠杆菌对盐和高温胁迫的抗性

扁蓿豆为高原高寒地区优质豆科牧草,具有极强的抗旱、耐寒、抗盐碱的能力。脱水素(DHNs)是参与植物逆境应答的一类蛋白。根据前期RNA-seq的结果,从扁蓿豆幼苗中克隆到一个编码脱水素的基因MrDHN3。序列分析显示该基因含666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸,为一个SK2型酸性脱水蛋白。氨基酸序列比对结果表明,MrDHN3与豆科植物白三叶和蒺藜苜蓿相似性最高,达83%。实时荧光定量PCR结果显示,MrDHN3基因受脱水、低温、高盐和脱落酸处理诱导表达,表明MrDHN3参与了扁蓿豆的非生物胁迫响应。通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中过表达MrDHN3蛋白,检测重组菌在盐和高温胁迫处理下的生长存活情况。结果发现,在0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl高盐胁迫条件下,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株;在55 ℃高温胁迫条件下, 转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照。表明MrDHN3对盐和高温引起的细胞损伤具有保护作用。为今后作物抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息。     

草地早熟禾NAC基因鉴定及非生物胁迫下表达模式分析

草地早熟禾(Poa pratensis)是世界上广泛应用的草坪草种,其抗逆基因的挖掘对抗逆新品种的选育具有重要意义.NAC基因家族是植物特有的转录因子之一,在植物逆境响应中起到重要作用.以二穗短柄草(Brach ypodium distach yon)的NAC蛋白序列为请求序列,从草地早熟禾转录组数据库序列比对分析得到15个草地早熟禾PpNACs基因的cDNA全长序列,具有完整的开放阅读框.运用生物信息学方法预测早熟禾NAC家族成员的理化性质和保守结构域,发现15个PpNACs转录因子都是酸性蛋白,除PpNAC16外都属于不稳定蛋白,疏水性蛋白,具有相似的结构,通过聚类分析可将15个PpNACs成员分为3类.荧光定量PCR结果显示,在重金属胁迫下显著上调表达的基因有Pp-NAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24,在盐胁迫过程下显著上调表达的基因有PpNAC10和PpNAC24,在干旱胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13,在低温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18,在高温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC20.其中,PpNAC10在重金属、盐、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,Pp-NAC18在重金属、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,PpNAC10和PpNAC18可作为草地早熟禾逆境胁迫响应的候选基因.     

基于转录组测序的青藏扁蓿豆EST-SSR标记开发与验证

青藏扁蓿豆(Medicago archiducis-nicolai)广泛分布于青藏高原及其毗邻地区,对高海拔极端环境具有极强的适应性。本研究利用高通量转录组测序数据,对青藏扁蓿豆的EST-SSR标记进行了开发。结果发现,随机选取的477对引物中,350对可在青藏扁蓿豆中有效扩增,其中346对引物在扁蓿豆(M.ruthenica)中可实现跨物种扩增。利用其中64对独立遗传且符合哈迪–温伯格平衡的标记引物对青藏扁蓿豆和扁蓿豆野生群体的遗传多样性和群体遗传结构分析发现,两个物种存在明显的种间和种内的遗传分化,且提示种内群体间的遗传分化与地理隔离或环境选择有关。本研究所开发的EST-SSR标记为今后进一步评价青藏扁蓿豆和扁蓿豆的遗传多样性以及解释其适应极端环境的遗传机制提供了重要的研究工具。     

基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遗传多样性及其群体遗传结构分析

利用青藏高原及其毗邻地区的7个青藏扁蓿豆(Medicago archiducis-nicolai),以及来自上述地区和内蒙古的3个扁蓿豆(M.ruthenica)野生群体,根据叶绿体trnL-trnF基因间隔区序列,对其遗传多样性和群体遗传结构进行了分析。对161个个体的trnL-trnF序列的分析,共检测到11个核苷酸变异位点,定义了14种单倍型。对单倍型在不同群体中的分布分析显示,青藏扁蓿豆在青藏高原东南边缘地区可能存在避难所,同时在青藏高原边缘地区可能发生了青藏扁蓿豆向扁蓿豆群体的基因入侵。空间分子变异分析和基于K-2P遗传距离的群体聚类均支持将上述群体分为扁蓿豆和青藏扁蓿豆两组,组间的遗传分化程度很大。分子变异分析表明,群体内的遗传变异明显大于群体间的变异,但部分群体间存在较高水平的遗传分化;错配分布和中性检验表明,在采样范围内两种扁蓿豆都没有经历明显的近期种群扩张。研究认为,青藏高原复杂的地形结构、冰期时的气候波动以及扁蓿豆本身的进化历史可能是造成其现今遗传结构形成的主要原因。     

紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

HD-Zip(Homologous structural Domain-leucine Zip,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子，其中HB1属于HD-ZIP I亚族。通过调节植物体内的内源激素含量变化，HB1转录因子可以提高植物对干旱、高盐等不利环境的抵抗能力。本文为探究紫花苜蓿HB1基因的生物学功能，采用RT-PCR技术成功克隆了MsHB1基因。其编码区长867 bp,编码288个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明，HB1蛋白为不稳定蛋白。系统发育树分析表明HB1蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)同源蛋白的亲缘关系接近。构建MsHB1的原核表达载体，在大肠杆菌BL21中成功诱导紫花苜蓿MsHB1蛋白表达，Western Blot也证实MsHB1蛋白表达成功。表达分析显示：MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中均有表达，在不同发育阶段中，幼嫩的叶片中表达最高。MsHB1在NaCl和ABA处理时的基因表达水平升高，推测MsHB1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用。     

植物AP2/ERF类转录因子研究进展

AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)是植物中广泛存在的一类超大家族转录因子,含有1～2个约由60个氨基酸组成AP2/ERF结构域,根据AP2/ERF结构域的数量及结合序列可以将其分为5个亚家族:AP2(APETALA2)、 ERF(ethylene-responsivefactor)、 DREB(dehydration-responsiveelement-bindingprotein)、 RAV(relatedto ABI3/VP1)和Soloist。该家族转录因子在调控植物生长发育及响应逆境胁迫过程中发挥重要作用,本文重点介绍了近年来AP2/ERF类转录因子参与植物花发育、果实发育、种子发育等生长发育过程以及调控植物对病原体、干旱和高盐等逆境胁迫的响应过程等方面的研究进展,可为今后挖掘和利用该类转录因子基因提供参考。     

日本结缕草ZjERF2基因的克隆、转录激活活性、 亚细胞定位和表达分析

采用RACE的方法,克隆了日本结缕草(Zoysia japonica)ZjERF2基因(GenBank登录号为MH479420)。其开放阅读框为825 bp,编码274个氨基酸,含有一个高度保守的AP2结构域,具有典型的ERF转录因子特征。遗传进化分析表明其与黍(Panicum hallii)ERF亲缘关系最近。利用染色体步移的方法克隆ATG上游1 549 bp的启动子序列,PLACE预测其含有多个响应激素和胁迫处理的作用元件。构建了pGBKT7-ZjERF2载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S??ZjERF2?YFP载体,本生烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达结果证明ZjERF2定位于细胞核。利用实时荧光定量的方法分析了ZjERF2的表达特征,结果表明ZjERF2基因在日本结缕草不同部位及不同发育时期表达量均有差异,在成熟叶片表达量最高。此外ZjERF2表达受ET、MeJA的诱导,但受ABA、PEG和NaCl的抑制。本研究表明ZjERF2是一个参与多种信号转导途径的转录因子。     

长叶红砂RtMYB1基因的克隆及表达

MYB转录因子家族在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。基于转录组测序数据,从珍稀泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)中克隆一个MYB转录因子基因,命名为RtMYB1。RtMYB1基因具有780bp的ORF(open reading frame)序列,编码236个氨基酸残基组成的蛋白。RtMYB1能够被盐、冷、高温、紫外照射(UV)和干旱(PEG)5种非生物胁迫诱导表达,这表明RtMYB1基因可能参与长叶红砂响应非生物胁迫的调节途径。本研究为深入了解长叶红砂的抗逆机理及发掘优异的抗逆基因奠定了基础。     

紫花苜蓿耐盐性相关NAC转录因子的挖掘及表达分析

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)是植物特有的一类转录因子家族,可调控植物响应盐胁迫。本研究基于盐胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)耐盐品种GIB和盐敏感品种LS根和叶的转录组数据,通过生物信息学方法筛选出17个差异表达的MsNAC转录因子家族成员,并对其序列特征、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的表达模式等进行分析。结果显示,17个MsNACs均具有NAC典型的NAM结构域,且蛋白结构相似。系统进化分析将17个MsNACs分成8个亚族,各亚组成员具有高度相似的保守基序。顺式作用元件分析发现,有15个MsNACs具有ABA响应顺式元件ABRE。转录组数据表达模式分析与RT-qPCR验证结果显示MsNAC1,MsNAC2,MsNAC35,MsJUB1和MsNAC40基因在盐处理下GIB叶中上调表达,在LS叶中下调或者未发生变化,推测这些基因参与调控紫花苜蓿的耐盐反应。本研究为进一步研究紫花苜蓿NAC转录因子响应盐胁迫功能提供参考依据。     

紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化

采用RACE技术以一段紫花苜蓿(Medicago sativa)盐诱导基因的EST(expressed sequence tag)序列为模板设计引物克隆此基因的全长序列.序列分析结果表明,该基因全长1551 bp,包含一个1230 bp的最大开放阅读框,编码409个氨基酸,包含3个RNA结合蛋白结构域(RRM domain),命名为MsRBP(GenBank accession No.JN986878.1).亚细胞定位分析表明此基因编码蛋白定位于细胞核.经同源比对和进化树分析,MsRBP基因编码的氨基酸序列与截形苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Gl ycine max)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中的某些RNA结合蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性.RT-PCR (Real-time PCR)分析结果表明,在NaCl,ABA和PEG胁迫下MsRBP基因的表达水平均上调,推测该基因可能在紫花苜蓿逆境胁迫调控中发挥重要作用.经构建植物超表达载体pBI21-MsRBP,采用农杆菌介导法对烟草(Nicotiana tabacum)进行遗传转化,获得了抗性转化再生植株.通过PCR,RT-PCR及GUS组织化学染色分析表明:MsRBP基因在烟草的基因组中能够进行转录和表达.本研究为该基因的功能鉴定与调控机制研究奠定了基础.     

蒙古冰草ERF转录因子生物信息学及其表达分析

ERF(Ethylene responsive factor)家族是植物中一种重要的转录因子，参与植物生长发育和逆境胁迫响应。为筛选蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)抗旱相关的ERF转录因子，本研究利用生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、进化关系及其二、三级结构进行分析，同时对不同干旱处理下的ERF基因进行表达分析。结果显示：筛选得到18个具有ERF结构特征的蒙古冰草ERF转录因子，蛋白大小在70～404aa之间，分子质量在7447.54～43654.9之间，理论等电点(PI)在4.53～11.10之间，其中有2个疏水性蛋白，其余均为亲水性蛋白，大部分定位于细胞核。ERF转录因子的二、三级结构以无规则卷曲为主，推测motif1，motif2，motif3为保守基序。进化关系比对发现AmERF053，AmERF1B，AmERF4-1，AmERF4-2与已知具有抗旱功能的蛋白具有较高同源性，且在干旱处理的蒙古冰草中显著差异表达。     

油莎豆CeWRKY转录因子响应非生物胁迫的功能表征

油莎豆亦称油莎草,地上部分是优质牧草,地下块茎可积累大量油脂,抗逆性强、适应性广,是一种新型饲草和油料作物。WRKY是一类数量庞大的转录因子超家族,广泛参与调控植物生长发育、物质代谢和胁迫应答等生理过程。然而,有关于油莎豆WRKY家族成员及其功能知之甚少。本研究基于转录组分析,鉴定出67条油莎豆WRKY转录因子。系统发育树结果显示,油莎豆CeWRKY与拟南芥AtWRKY类似,分为I、Ⅱ、Ⅲ3个亚家族。CeWRKYs均具有典型的WRKY结构域和锌指结构域,其中7条蛋白序列的WRKY结构域存在变异,可能与WRKY成员功能歧化相关。油莎豆CeWRKY蛋白的序列长度、相对分子量、等电点等存在较大差异,均为亲水性蛋白,不含跨膜结构,亚细胞定位预测均位于细胞核。CeWRKY基因在块茎发育时期的表达模式具有时空特异性。不同CeWRKY基因参与不同逆境胁迫响应,其中CeWRKY8基因分别在干旱、盐、碱胁迫处理的油莎豆幼苗中表达谱变化显著,可能是参与油莎豆逆境胁迫响应调控的一个主效转录因子。本研究为深入解析油莎豆CeWRKY转录因子的多样性生物学功能以及介导逆境胁迫应答的分子机制奠定了基础,亦为优质高抗...     

日本结缕草ZjERF1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

ERF转录因子是植物体内最大的一类转录因子之一,在调控植物生长发育和响应环境胁迫等方面发挥着重要的作用。研究利用RACE技术,从日本结缕草中克隆到ZjERF1基因(GenBank登录号为MH294481),开放阅读框为630 bp,编码209个氨基酸残基,含有1个高度保守的AP2结构域,属于典型的ERF转录因子。利用染色体步移技术,成功获得ATG上游1581 bp的启动子序列,生物信息学分析表明其中含有多个响应MeJA等激素和非生物胁迫的作用元件。为分析其转录激活特性,构建了pGBKT7-ZjERF1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S::ZjERF1:YFP载体,本生烟草瞬时表达结果证明ZjERF1定位于细胞核。为进一步研究ZjERF1的表达特征,利用实时荧光定量的方法进行了验证,结果表明:ZjERF1在日本结缕草茎中表达量最高,并且与叶片的衰老程度呈正相关性;此外ZjERF1的表达可受200μmol·L^-1 ET、10μmol·L^-1 MeJA和300 mmol·L^-1 NaCl处理的诱导,但受到20%PEG4000的抑制。研究表明ZjERF1是一个可参与多种信号转导途径的优良转录因子,为进一步探索ZjERF1基因的功能及其调控机制奠定了基础。     

柑橘TIFY基因的结构特征及响应低温的表达分析

TIFY基因家族是一类包含TIFY结构域的植物特有转录因子,与植物的生长发育密切相关,且在非生物逆境响应中起着重要作用。本研究基于柑橘基因组测序结果,分析了3个TIFY基因家族成员的基因结构特征,并利用qPCR分析了低温胁迫下这些基因的表达水平。结果表明：(1)3个TIFY基因含有TIFY结构域和Jas motif,属于JAZ蛋白亚家族基因;(2)3个TIFY基因的启动子含有LTR、DRE core、STRE、TC-rich repeats等逆境相关顺式作用元件以及MeJA响应元件、ABA响应元件等激素响应相关元件,推测3个TIFY基因可以响应多种非生物胁迫;(3)Cs1g17220和Cs4g07130在果实中高表达,推测其可能与果实发育相关;(4)3个TIFY基因受低温诱导在早期上调表达,且受低温胁迫的程度越大,其受诱导上调表达的倍数越高。本研究将为进一步解析TIFY基因家族在柑橘中的作用和功能提供重要线索。     

紫花苜蓿bZIP基因家族的鉴定、 进化及表达分析

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。目前在许多植物中已发现大量的bZIP转录因子,这些bZIP转录因子成员广泛参与种子贮藏基因的表达、植物的生长发育、光信号传导、病害防御、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等各种信号的反应。本研究首次从紫花苜蓿(Medicago sativa)全转录组水平鉴定出bZIP转录因子家族共包含138个基因,根据bZIP蛋白序列进行系统进化分析可以将其分为10类;对MsbZIP基因的系统进化分析表明该基因家族在分类上有很高的保守性。该转录因子家族的基因密码子偏好性分析表明,MsbZIP基因密码子偏好使用A/T碱基。此外,MsbZIP基因GO功能注释分析结果显示,138个MsbZIP基因最终分为23个GO分类,总体包括分子功能和生物学过程两类。相关性分析结果表明,共有372对基因表达相关性极显著(P0.01)。本研究可为紫花苜蓿bZIP转录因子功能特性、进化历程和生物功能的深入研究奠定基础。     

黄花苜蓿AP2/ERF家族MfERF028基因的表达特性与耐寒功能分析

基于黄花苜蓿（Medicago falcata L.）转录组测序数据,克隆得到MfERF028基因,蛋白质编码区（Coding sequence,CDS）长度为672 bp,编码223个氨基酸。该基因编码的蛋白质相对分子质量为25.3 kDa,等电点为6.00;亚细胞定位表明该基因所编码的蛋白在细胞核内特异表达,基因表达模式分析表明对-8℃胁迫响应强烈。构建植物表达载体,并转入截形苜蓿（Medicago truncatula Jemalong A17）中进行基因功能验证,结果表明异源表达的转化植株遭受冷冻胁迫时MfERF028可上调MtCAS15A基因的表达。该研究为阐明AP2/ERF家族基因抗逆机制提供了理论依据,并为培育抗逆豆科牧草提供了新的候选基因。     

紫花苜蓿bZIP转录因子MsbZIP1的克隆、表达特性和遗传转化分析

bZIP（Basic leucine zipper）是植物中一类非常重要的转录因子,参与植物从生长发育到抗性调控的多个生物学过程。为了了解紫花苜蓿（Medicago sativa）中bZIP转录因子的特性,解析紫花苜蓿MsbZIP1基因的生物学功能,从而阐述MsbZIP1基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制,本研究利用RACE技术从紫花苜蓿中获得1个MsbZIP1基因的全长cDNA,该序列全长1 176 bp,编码361个氨基酸,预测分子量为42.3 kD,等电点为6.5。分析发现,该蛋白含有bZIP家族典型的BRLZ碱性结构域和亮氨酸拉链,属于bZIP家族蛋白。进化树分析表明,该蛋白属于bZIP转录因子C亚族,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtbZIP63具有很高的同源性,推测可能具有与该类蛋白相似的功能。qRT-PCR分析表明,MsbZIP1基因对干旱、高盐、高温、低温,以及脱落酸（Abscisic acid,ABA）和生长素（Auxin,IAA）处理都有不同程度的响应,推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1,以农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,经后代筛选、扩繁和分子检测,得到7株超表达的转基因拟南芥。本研究第一次分离了紫花苜蓿C亚族bZIP转录因子,初步确定紫花苜蓿MsbZIP1基因响应多种逆境胁迫的反应,并获得了阳性转基因材料,并为进一步探索该类转录因子在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

5份不同来源扁蓿豆幼苗期的耐盐性比较

为探讨不同地区扁蓿豆(Medicago ruthenica)耐盐性的生理生化机制,采用盆栽法模拟盐碱地条件,观测不同盐浓度对扁蓿豆幼苗各生理指标的影响。结果表明,随着盐浓度的增加,扁蓿豆叶片内脯氨酸、丙二醛相对含量和细胞膜透性均不断增加,叶片含水量下降。5份供试扁蓿豆中,来源于乌兰察布市四子王旗的扁蓿豆耐盐性最强,而来源于通辽市大青沟自然保护区的扁蓿豆耐盐能力最弱。