兽医临床诊断中心

<正>中心实验室总面积近1000m~2,设计布局严格按照省级兽医实验室的标准执行,除了标准要求的各功能实验室外,还建有60m~2的洁净实验室一间、20m~2的远程诊断实验室一间。2015年4月取得计量认证资质,证书编号:2015121569V。实验室拥有荧光定量PCR仪、梯度PCR仪、酶标仪、凝胶成像系统、台式高速冷冻离心机、超低温冰箱等先进仪器设备,可开展畜禽疫病的远程诊断、病理学和细菌学检测、药敏试验、病毒的病     

基于TT51-1水稻种子标准曲线检测的可靠性分析

为了分析在同一个实验室的2台不同型号的实时荧光定量PCR仪(扩增曲线和标准曲线的相关参数)可比性,在常规条件下,使用同一批号的试剂,将标准品及同一水稻种子样品TT51-1在2台荧光定量PCR仪上进行扩增,对标准曲线的参数及分析结果进行比对,分析其一致性。结果表明,作为单一的检测系统,运用同一批号试剂对相同标准品及待检样品的试验中,2台实时荧光定量PCR仪测定的结果差异没有统计学意义(P0. 05)。通过对标准曲线的相关参数和待检测样品的检测结果的分析,可以判定实验室存在的2台实时荧光定量PCR仪检测的结果的一致性,可确保检测结果可靠。     

两种仪器对羊毛细度检测结果的比对分析

利用激光细度测定仪和显微投影仪分别检测了国际毛纺协会实验室提供的标准毛条、实验室比对毛条、随机抽取的含脂毛共20个样品的细度,对检测结果比对分析发现,两种方法均可达到羊毛细度检测标准的要求;认为具有相同检测项目的不同仪器间进行比对试验是一种简单易行,及时找到系统误差的好方法;同时得出,在目前多数毛纺织企业和检测机构尚无激光细度仪时,可完全采用显微投影仪进行检测.     

转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子协同实验验证

对构建的适于转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子pEASY-RT73在普通PCR和实时荧光PCR检测中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对8家实验室结果的统计分析表明,标准分子pEASY-RT73对转基因油菜RT73品系特异性检测及油菜内源基因HMG和PEP检测具有高特异性。在普通PCR扩增中,标准分子对PEP和RT73品系特异性序列的检测下限均为20拷贝,对HMG基因的检测下限为50拷贝;在实时荧光PCR扩增中,HMG和RT73品系特异性序列的检测下限均为10拷贝,PEP检测下限为50拷贝。虽然各实验室所用仪器和试剂有较大差异,但对检测结果影响不大。因此,标准分子pEASY-RT73可稳定的作为新型标准物质用于转基因油菜RT73品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测。     

退火温度、DNA聚合酶和扩增仪对水稻品种真实性SSR分子检测质量的影响

SSR标记法已经被广泛应用到水稻品种真实性的鉴定中,此方法具有快速、稳定等特点。本研究对比了不同退火温度、DNA聚合酶以及PCR扩增仪等因素对水稻品种真实性SSR分子检测方法的影响,旨在探讨如何根据实验室自身情况选择适合的反应体系和反应条件来顺利地开展检测工作。结果表明,55℃退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测;2种PCR仪性能比较一致,均适合水稻品种真实性SSR标记的检测;Ta KaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测,天根Taq DNA聚合酶不适合水稻品种真实性SSR标记的检测。不同实验室,应选择以上3个适合实验条件进行组合,以提高水稻品种真实性和纯度分子检测的准确性。     

四种转基因玉米新型质粒标准分子协同实验验证

构建了分别适于转基因玉米GA21、TC1507、T25和Bt11品系特异性双重PCR检测标准分子,并对其在定性PCR检测体系中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对7家实验室返回结果的统计分析表明,标准分子pBt11、pTC、pT25和pGA分别对转基因玉米Bt11、TC1507、T25和GA21品系具有高特异性。4个标准分子在zSSⅡb和对应品系特异性序列单一PCR检测体系中检测下限均为50拷贝。因此,4个标准分子均可作为新型标准物质用于相应转基因玉米品系特异性定性检测。     

兽医实验室实验员荧光定量PCR理论与操作的调查分析及培训建议

通过在线问卷调查方式,获得包含广西壮族自治区市、县级疫控兽医系统及屠宰场、养殖场、第三方检测等实验室共172份实验员填写的样本数据。调查结果显示,广西兽医实验室实验员对荧光PCR仪的理论知识认知水平与实际操作熟练程度参差不齐。因此,为提高市、县级疫控兽医系统及屠宰场、养殖场、第三方检测等兽医实验室荧光PCR仪培训效率、提高实验室检测水平,应建立培训返岗机制、讲师培养机制、训前调研训后测评机制,鼓励基层实验员参与实验室培训工作,进一步完善兽医实验室培训制度。     

Jabber协议与H.264标准在农业远程诊断中的应用研究

阐述了将Jabber协议与H.264标准应用于农业远程诊断的工作原理和各级系统框架,设计并实现农民与专家远程音频、文字、白板等即时通信。系统测试表明,基于Jabber协议与H.264标准的农业远程诊断技术能够实现专家和农户间的双向视频沟通,能帮助农户远程诊断农业病虫害,而且系统在运行过程中消耗网络带宽较少,运行稳定。     

如何做好兽医实验室荧光定量PCR理论与操作的有效培训

通过在线问卷调查方式,得到包含广西市、县、屠宰场、养殖场、第三方等实验室共172份实验员填写的样本数据,调查结果提示了广西兽医实验室实验员对荧光PCR仪的理论知识认知水平与实际操作熟练程度参差不齐,因此,为提高市县级、养殖场、第三方等兽医实验室荧光PCR仪培训效率、提高实验室检测水平,应建立培训返岗机制、讲师培养机制、训前调研训后测评机制, 鼓励基层实验员参与实验室培训工作, 进一步完善兽医实验室培训制度。     

一例荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌和牛肺炎支原体混合感染犊牛的诊治

新疆某牛场的犊牛出现咳喘、鼻镜干燥、精神不振、食欲废绝、呼吸困难甚至出现死亡的症状,通过对患病牛群的发病情况、剖检、细菌分离鉴定、PCR鉴定等试验方法进行检查。结果显示:病死牛肺部可见明显出血并且伴有肺部实质性肝变;牛支原体和多杀性巴氏杆菌PCR检测都为阳性,曼氏杆菌PCR检测为阴性。通过实验室诊断最终确定该牛场为多杀性巴士杆菌和牛肺炎支原体混合感染。本研究通过病理变化、实验室诊断等方法找到病因,为此类疾病的防控提供借鉴意义。     

转基因玉米T25数字PCR方法的建立与验证

转基因安全管理和标识制度的实施需要标准化的检测方法和转基因检测标准物质，标准物质是获得准确、可靠、可比检测结果的保证。转基因玉米T25为我国批准进口用作加工原料的转基因植物。为加强对T25的监管，以T25基体标准物质为研究对象，建立数字PCR方法，并选择8家实验室，采用数字PCR联合定值测定。结果表明，T25/Adh1二重数字PCR系统具有良好的扩增特异性。初始模板量在100～10 000拷贝·μL-1之间可获得稳定、可靠的检测结果。通过多实验室协同定值说明T25/Adh1二重数字PCR方法准确、可靠。T25基体标准物质的量值为1.001 2，相对不确定度为0.001 6。研究表明建立的T25/Adh1二重数字PCR方法可以用于转基因玉米T25的定量检测，为转基因成分定量检测提供了物质基础和技术保证。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒（ENTV-2）SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R~2=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10~2 copies·μL~(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。     

如何及时监测麦瘟病入侵？ 田间快速检测新方法来了

正中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队与俄亥俄州立大学、孟加拉国谢赫穆吉布拉赫曼农业大学、巴西圣卡洛斯联邦大学和美国农业部合作开发出一种检测田间麦瘟病发生的新方法,该方法不依赖实验室PCR仪等专业设备,实现了麦瘟病的田间快速核酸检测。通过与巴西、孟加拉国等合作单位对早期侵染材料进行检测发现,     

转基因大豆RoundupReady的高通量PCR检测

以转基因大豆标准品(BF410f)为材料,以标准PCR检测方法为基础,根据不同标准检测参数的兼容性和PCR对引物退火温度的要求,设计高通量的PCR检测方法,从大豆中快速准确地检测出Lectin、CaMV35S、CP4-EPSPS、NOS等转基因元件,提高了PCR检测效率,节约了时间.另通过梯度PCR仪摸索出合适的反应体系:预变性T＝94 ℃,5 min;变性温度T＝94 ℃,30 s;退火温度T＝58 ℃,30 s; 延伸温度T＝72 ℃,延伸40 s.35个循环后,所有受试元件均得到了扩增,很大程度地提高检测效率,该方法对于引物理论退火温度在50～60 ℃范围内具有广泛的适用性.     

4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）、牛恶性卡他热病毒（MCFV）4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10¹,1.4×10³,9.1×10¹和1.2×10²拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10～1 000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%（BCoV）、97.4%（BRV）、100.0%（BVDV）和100.0%（MCFV）。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。     

面团流变学特性检测仪器比对试验分析

 【目的】研究不同实验室粉质仪和拉伸仪测定面团流变学特性的准确度和精确度,探讨现有仪器设备存在的主要问题。【方法】以3种小麦面粉标准样品(强筋、中强筋和弱筋)为原料,以不同实验室的17台粉质仪和11台拉伸仪为比对仪器,分析不同实验室粉质仪和拉伸仪测定面团流变学特性的准确度和精确度。【结果】17台粉质仪器检测3种面粉的准确度约为72%,其中有13台粉质仪重复试验的精确度约为73%;不同粉质参数之间的准确度无显著差异,而精确度存在显著差异;不同面粉间粉质参数准确度无显著差异,而精确度有显著差异。11台拉伸仪检测3种面粉的准确度约为73%,其中有7台拉伸仪重复试验的精确度约为95%;不同拉伸参数之间准确度达到满意程度无显著差异,有问题和不满意的比例有显著差异,同时精确度无显著差异;不同面粉间拉伸参数准确度无显著差异,而精确度存在显著差异。【结论】粉质仪比对试验的结果说明,有1/4以上的仪器维护水平和技术队伍现状还不能完全满足国家技术标准对优质小麦检测、监测、评价的要求。     

检测牛感染犬新孢子虫的TaqMan-MGB Real-time PCR方法的建立

为建立牛感染犬新孢子虫的Real-time PCR检测方法,根据犬新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立新孢子虫病TaqMan-MGB Real-time PCR检测方法。PCR扩增产物约为150bp,与预期片段大小相符;Real-time PCR扩增表明,Ct值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系;当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性DNA时均为阴性;经3D数字PCR判定,Real-time PCR方法的最低有效检测量为6.41拷贝/μL,灵敏性是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内平均变异系数为1.108%,组间为2.732%;本方法与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为100%(46/46)。该Real-time PCR方法可用于早期诊断和日常监测家畜感染犬新孢子虫。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒的研制及应用

为了开发针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及其试剂盒,对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物和探针,采用荧光定量PCR方法检测PCV2。试验表明:该方法循环阈值(Ct)与标准DNA模板在10~1—10~7拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系,相关系数为0.9999;重复性好,批内试验中Ct值的变异系数在0.59%—1.05%,批间试验的Ct值变异系数为1.9%—4.2%;研制的检测试剂盒与猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)不发生交叉反应,检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。用此方法对1 000个临床样品进行检测,结果710个被检测为阳性。结果显示,所研制的PCV2诊断试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性好,为PCV2的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的诊断方法。     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR标准曲线的建立

笔者针对传染性支气管炎病毒（IBV）M41株中编码核衣壳蛋白的N基因设计并合成一对引物,通过构建重组阳性标准质粒的方法,成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测IBV的标准曲线。该方法所建立的曲线可检测到初始模板中5×10^2copies／μL的病毒核酸,与常规PCR相比敏感性大大提高。笔者建立的荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于传染性支气管炎的临床诊断和健康带毒鸡群的检测。