新城疫灭活标记疫苗(MG7株)对新兴土鸡2号免疫持续期研究

正新城疫是危害我国养禽业最严重的疫病之一,该病为OIE所规定的动物必报疫病,也是我国规定的一类动物疫病,世界各国对该病的防控和研究一直十分重视。目前我国防控新城疫主要使用La Sota和Clone30两种疫苗株,二者均属于基因Ⅱ型;而田间流行的毒株主要是基因Ⅶ型NDV,所以上述两种疫苗不能在临床应用上     

新城疫强毒河南株分离鉴定及新城疫二价油乳剂灭活苗研制

从豫北某蛋鸡场病死鸡中分离出一株病毒，经HA试验、HI试验、电镜观察、回归试验确认所分离毒株为新城疫病毒，经对分离株MDT、ICPI测定表明该分离株为新城疫强毒。对该分离株进行抗原性变异检测和基因型鉴定，证明为基因Ⅶ型新城疫病毒。用新城疫Lasota株和新城疫Ⅶ型毒株制备成新城疫二价油乳剂灭活苗，在河南一些种鸡场和蛋鸡场应用，获得了满意的效果，有效地控制了新城疫的发生和流行。     

我国新城疫病毒的分子流行病学及新疫苗研制

当前我国及周边地区流行的新城疫病毒主要为基因Ⅶ型,而目前所使用的疫苗主要为基因Ⅱ型La Sota株,其与流行株的遗传距离较远。疫苗株与流行株之间的基因型差异被认为是免疫禽群中新城疫强毒发生感染的主要原因之一,为提高疫苗的免疫效力,成功研制出了基因Ⅶd亚型新城疫病毒致弱株,该致弱株在控制当前新城疫的发生和流行方面具有较大的优势和潜力。     

2005年中国新城疫病毒分子流行病学研究

采用2005年从国内不同地区、不同宿主分离到的NDV分离株，选取其中具有代表性的83株，用RT-PCR技术扩增其F基因重要的功能区片段，进一步进行序列测定。序列分析表明所扩增的目的片段长度为535bp，序列测定结果已经登陆到GenBank，登陆号为DQ439866-DQ439948。参照国内外已发表的部分毒株的F基因序列，构建了NDV的遗传进化树，分析毒株间的遗传进化关系。通过遗传进化分析表明83株NDV分离株中有65株属于基因Ⅶ型，9株属于基因Ⅱ型，5株属于基因Ⅰ型，3株属于基因Ⅵ型，1株属于基因Ⅲ型。表明我国目前ND的流行情况比较复杂，其中基因Ⅶ型新城疫病毒所引起的新城疫在国内呈流行趋势，同时也存在其它基因型的散发，从而为我国目前新城疫的防治提供了科学的参考依据。     

我国新城疫病毒分离株分子生物学特性和基因型的研究

利用一步法RT-PCR技术成功扩增了37个新城疫病毒分离株的(其中2株属于鸽源病毒)F基因片段(约500bp)，通过对分离株的测序和基因分型表明，24株属于基因Ⅶ型，1株属于基因Ⅵ型，2株属于基因Ⅲ型，1株属于基因Ⅰ型，6株属于基因Ⅱ型，另外有3株从氨基酸方面分析是基因Ⅶ和Ⅵ型的杂交体，但从进化树方面，分离毒SD054和SD069属于基因Ⅵ型，SD052属于基因Ⅶ型。可以看出，我国新城疫的流行是极其复杂的，既有老基因型的威胁，又有新基因型的不断流行，同时发现有3株病毒发生了两基因型间的杂交现象。     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

2018〜2019年我国部分地区新城疫病毒的F基因序列分析

本研究自2018-2019年从疑似感染新城疫的家禽病料分离鉴定出13株新城疫病毒(Newcastle disease viruses,NDV),采用RT-PCR方法对这13株NDV分离株的F基因进行扩增,产物经TA克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株进行遗传进化分析。结果显示,其中的7株属于基因Ⅱ型,5株属于基因VI型,1株属于ClassⅠ亚型。F基因相似性分析结果显示,7株基因Ⅱ型毒株与疫苗株La Sota.Bl sClone 30的核昔酸相似性在9&1%-100%之间,氨基酸的相似性在97.6%~100%之间。5株基因VI型分离株与Ⅱ、Ⅶ型疫苗株及VIb亚型代表株之间的核昔酸相似性在79.7%-98.4%之间,氨基酸的相似性在76.6%-97.6%之间。1株基因Ⅰ型的分离株与Ⅱ,Ⅶ型疫苗株及Class Ⅰ代表毒株的核昔酸相似性在52.1%-97.3%之间,氨基酸的相似性在68.5%-96.8%之间,表明当前部分地区的NDV分离株与传统疫苗株之间存在较明显的遗传特征差异。     

如何预防和扑灭鹅副粘病毒病

(一)正确使用疫苗目前鹅副粘病毒病没有活苗可供使用,仅有灭活苗.鹅副粘病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型F基因Ⅶ型毒株,它不同于新城疫常用的弱毒苗和中等毒力疫苗的毒株,因基因型不同,而用上述新城疫疫苗株制备的灭活苗进行免疫不能防制该病的发生.应选用经过基因型鉴定的毒株制备灭活苗,才能确保有效的免疫效果.     

东北地区新城疫流行株的分子生物学特性调查

从东北地区发生新城疫(ND)的病鸡、病鸽和产蛋下降鸡分离到19株NDV，对其融合蛋白(F)基因532bp或280bp片段进行了克隆、测序(在GenBank中的登录号为AY208680～AY208698)，并对各株的F基因序列进行了比较。结果，各毒株之间的核苷酸同源性为83．1％～100％，氨基酸同源性为85．5％～100％；系统发育进化树分析表明，其中2株与疫苗株V4同属基因Ⅰ型，为弱毒株；其余17株为强毒株，其中2株为基因Ⅵ型，其余为基因Ⅶ型。表明东北地区目前由3种基因型的NDV毒株(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所引发，并以基因Ⅶ型为主。另外，对其中的代表毒株APMV1／chiclierl／China／JL-11／02进行了免疫学试验，结果显示，LaSota疫苗的免疫保护效果不理想，可能是LaSota疫苗免疫鸡群发生ND的主要原因。     

东北地区不同宿主NDV分离株的系统发育进化分析

本研究针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle disease，ND）抗体鸡群仍然发生ND的情况，对所分离的18株鸡源新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）和1株鸽源NDV的融合蛋白（F）基因（532bp或280bp）高变区片段进行扩增、克隆和测序（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。结果表明，各分离毒株之间核苷酸同源性为83．1％～100％。各分离株间的氨基酸同源性为85．5％～100％。系统进化树分析表明，IL-12、HLJ-3与V4株同属于基因Ⅰ型；HLJ-4,JL-14为基因Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型。可见目前东北地区ND的流行是由三种不同基因型毒株，老的基因Ⅰ型、Ⅵ型，新的Ⅶ型所引发，但以基因Ⅶ型为主要流行株，这与我国其他地区和世界其他国家的ND流行情况相一致。     

鸽新城疫病毒北京分离株F基因的遗传进化分析

对一株分离自北京市的鸽源新城疫病毒BJP13株的F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示,F基因核苷酸序列长为1 662bp,编码553个氨基酸,蛋白裂解位点的序列为112RRQKRF117,具备强毒株的序列特征;同源性比较显示,BJP13与国内外不同基因型毒株的同源性在87.9%~99.1%;与新城疫基因Ⅵ型的同源性较高,为93.7%~99.1%,其中与基因Ⅵb亚型中的毒株11和毒株LLN713同源性最高为99.1%,与1996年北京分离株STP96的同源性最低为93.7%;与基因Ⅰ型疫苗株V4株和基因Ⅱ型疫苗株La Sota株的同源性分别为90.3%和88.6%;遗传进化分析显示,北京分离株BJP13与比利时毒株11、4940和中国毒株SDS、LLN713最为接近,位于同一进化分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的序列分析与基因分型研究

采用RT-PCR技术对2008～2009年间从我国部分省市分离的9株新城疫病毒的F基因进行扩增和测序,并进行了遗传进化和基因分型研究。结果表明,9株分离株的F基因的开放性阅读框架(ORF)长度均为1662bp,其中8株的F基因裂解位点属于强毒株模式,1株为弱毒株模式;分子进化和基因分型研究表明,8株强毒株均属于基因Ⅶ型d亚型,1株弱毒株为基因Ⅱ型。提示近年来流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型强毒株引起的,从而为强毒力新城疫的防控提供科学依据。     

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年闯洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同，15个地方毒株可分为3群，群内各毒株同源性较高，群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株，涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区；第2群4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株。分散于进化树的基因Ⅵ型区；第3群2株，属古典基因Ⅱ型的弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明，近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短，株间差异不大。     

六株鸽源新城疫病毒的分离、鉴定及生物信息学分析

新城疫是严重危害世界养禽业的一种禽类传染病。近年来,鸽新城疫的流行越来越严重,引起了养殖户和兽医工作者的广泛关注。本研究在4批发病鸽组织病料中分离到了4株鸽源新城疫强毒株和2株鸽源弱毒株。病毒分离株经鸡胚有限稀释法纯化5次后,新鲜尿囊液用于提取病毒RNA。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。通过对F基因的遗传进化分析发现,4株鸽源强毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型,2株鸽源弱毒株与Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。进一步遗传进化分析结果显示,4株鸽源新城疫病毒强毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与欧洲流行株亲缘关系十分相近,而与中国20世纪90年代鸽源分离株遗传距离稍远,因此推测当前鸽源流行强毒株可能源自欧洲。生物信息学分析显示鸽源毒株HN蛋白345~353位的一个线性抗原表位发生了改变,而血清学实验显示La Sota疫苗株和鸽源毒株的交叉血凝抑制存在明显差异,暗示鸽源毒株已经发生了抗原性变异。因此,使用鸡疫苗株La Sota免疫鸽存在免疫失败的风险,需要研发鸽专用新城疫病毒疫苗用于鸽新城疫的防疫工作。     

新城疫病毒的基因分型与分子流行病学

对新城疫流行以来不同时期基因型的变化和分子流行病学进行了综述,阐明了1926年起源于东南亚的第1次ND大流行是由基因Ⅱ～Ⅵ型引起的;1960年末到1973年的第2次大流行是由基因Ⅴ～Ⅵ型引起的;70年代末后的第3次大流行主要是由基因Ⅵ型引起的;而目前我国流行的NDV毒株既有老的基因Ⅵ型,又有新的基因Ⅶ型流行,更存在我国特有的基因Ⅸ型,特别是基因Ⅶ型在目前的流行似乎已十分普遍.     

鸡新城疫油乳剂灭活苗

鸡新城疫防制工作中,目前已有Ⅰ系,Ⅱ系,La sota系,F系以及Clone-30,N-79等弱毒疫苗供人们选择。但弱毒苗特别是Ⅱ系苗在使用过程中,免疫有时不甚理想,使养鸡者十分担心。1985年起,我公司在近10万只鸡上推广应用一种新疫苗—新城疫油乳剂灭活苗,取得了较为满意的效果,现介绍如下。     

鸡新城疫病毒基因Ⅶ型和LaSota株灭活疫苗免疫保护效力观察

新城疫是危害我国养禽业的重要疫病之一,新城疫病毒(NDV)流行毒株有多种基因型,其中基因Ⅶ型毒株流行较为普遍。本研究利用流行病学调查中筛选出的NDV LY1分离株(基因Ⅶ型)和传统的LaSota株(基因Ⅱ型)与油佐剂按1∶3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1、LY1+LaSota和LaSota油乳剂灭活苗。免疫试验结果显示,LY1灭活疫苗组HI抗体效价较低,LY1+LaSota疫苗组HI抗体水平稍高于商品化LaSota疫苗组(P>0.05),抗体产生规律相似;利用LY1分离株攻击,LY1+LaSota株组免疫保护率达100%,明显高于LY1分离株灭活疫苗组及商品化灭活疫苗组。本试验为新城疫新的疫苗研究开发奠定了基础。     

两种新城疫灭活疫苗免疫原性比较

新城疫作为家禽养殖业危害最大的疫病之一,近些年来常发生免疫失败的现象,究其原因,由于免疫压力的增大和变异株的增多,使疫苗的免疫效果受到极大的挑战,因此选择合适的病毒株制备疫苗对免疫效果具有重要的意义。论文通过测定抗体水平比较新城疫基因Ⅶ型A-Ⅶ株和传统基因Ⅱ型La Sota株油乳剂灭活疫苗对鸡只免疫效价的影响,通过攻毒后的保护、排毒情况及病毒载量的研究,综合比较了2种毒株的免疫原性。通过本试验发现,利用基因Ⅶ型A-Ⅶ株灭活苗与基因Ⅱ型La Sota株灭活苗免疫SPF鸡后,A-Ⅶ株灭活苗所产生的HI抗体效价明显高于La Sota株灭活苗。而通过基因Ⅶ型YND株和标准强毒F48E9株攻毒试验结果显示,2种疫苗均能100%的保护鸡只不死亡,但A-Ⅶ株比La Sota株灭活苗能够更好地抑制强毒在体内的复制和排毒。由此可见,基因Ⅶ型A-Ⅶ株对不同基因型强毒的抵抗能力优于基因Ⅱ型La Sota株,具有更好的免疫原性,通过本试验可为新城疫的防控选择合适的疫苗提供一定的参考。     

新城疫病毒基因型差异性单克隆抗体的制备及鉴定

目前新城疫病毒(NDV)弱毒株的混杂对禽病实验室病原诊断工作造成很大困扰,NDV强弱毒株以及基因型的快速鉴别是亟待解决的重要问题。研究选用一株与疫苗株La Sota存在显著抗原性差异的强毒株PI/CHINA/SD/2012/167制备油乳剂疫苗免疫小鼠制备单克隆抗体。采用间接ELISA检测抗体对该强毒株及La Sota株的反应性,筛选广谱型和强弱毒株差异型的单克隆抗体,最终获得2株存在基因型差异的单克隆抗体。其中,3F10株不与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应,而与其他毒株都有很好的反应性,而7E11株不仅与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应性弱,而且与La Sota株和Mukteswar株的反应性也远远低于ClassⅠ基因Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型的强毒株。为了确定两株克隆抗体靶向的病毒蛋白,构建了NDV蛋白真核表达质粒转染DF1细胞,并利用Western blot和间接免疫荧光试验进行检测。结果显示,3F10针对NDV M蛋白,而7E11针对NDV F蛋白。两株单克隆抗体与NDV不同基因型毒株反应的差异性为NDV的鉴别诊断技术研究奠定了基础。     

2008-2009年部分地区新城疫病毒分离株的进化分析

本研究旨在从分子水平上掌握中国新城疫病毒的变异情况和新城疫的流行规律,对2008-2009年从中国部分省市养殖场分离的9株新城疫病毒毒株,采用RT-PCR方法扩增其F和HN基因,经克隆和测序,对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,9株分离株有8株为基因Ⅶ型,1株为基因Ⅱ型,F基因开放性阅读框架(ORF)为1662 bp,强毒株同La Sota的核苷酸同源性为83.5%~84.2%。HN基因开放性阅读框架(ORF)为1716或1734 bp,强毒株在538位缺失1个糖基化位点。结果表明,近年流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型NDV引起,F和HN基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。