小金海棠超氧化物歧化酶基因MxSod2克隆与序列分析

以苹果属植物小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材,利用差异筛选消减cDNA文库和RACE相结合的方法,分离到了小金海棠超氧化物歧化酶基因MxSod2(Genbank登录号为DQ431473),该基因全长805个碱基,开放阅读框为471 bp,编码157个氨基酸,推测分子量15 kDa.该基因具有CuZn.SOD基因的典型结构域特征.通过系统进化树分析,小金海棠MxSod2与龙眼、荔枝等非禾本科植物保持了较近的亲缘关系,与花生、水稻、玉米等禾本科植物亲缘关系较远.     

小金海棠中抗缺铁相关基因的杂交分析

 以高效抗缺铁胁迫基因型苹果种小金海棠 (MalusxiaojinensisChengetJiang)为试材 ,以异源的玉米Fe(II) 转运蛋白基因 (irt)和小麦Nramp基因为探针进行了杂交分析。Southern杂交结果表明 ,小金海棠基因组中该两家族基因均存在。Northern杂交结果表明 ,在根中 ,irt的转录受缺铁胁迫诱导 ,并随缺铁胁迫处理天数的增加而加强 ;在根和叶中 ,Nramp基因均能得以转录且叶中的转录受缺铁胁迫诱导而加强     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础.试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(ETA-Fe2 ,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2 ,40μmol/L)的根的总RNA,经过LD-pCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库.用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300～800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果.     

小金海棠实生树阶段转变过程中miR156表达及氧化还原平衡态的相关性分析

为证明苹果实生树童性变化与氧化还原平衡态的相关性,采取小金海棠实生树不同节位的叶片,测定miR156相对表达量,H2O2含量以及CAT、APX和GR酶活性。结果小金海棠实生树个体生长发育过程中miR156相对表达量从1.4m高度显著降低。叶片H2O2含量,CAT、APX和GR酶活性均随节位逐渐升高。表明植物体内活性氧清除机制的CAT途径和抗坏血酸-谷胱甘肽循环均随个体发育逐渐增强。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因MxYSL7的克隆与表达分析

为了解铁高效基因型小金海棠抗缺铁的分子机制,对与铁运输相关的YSL基因进行了克隆与分析.分析苹果的EST库得到一个686 bp的YSL基因片段.经3′-RACE及后期拼接得到1 500 bp的该基因的3′端序列.其预测蛋白含10个跨膜区,与拟南芥AtYSL7基因同源性达71%,命名为MxYSL7.RT-PCR及Northern分析表明,小金海棠的该基因只在地上部分表达:在茎与成熟叶中,随着低铁处理时间的延长,该基因表达量减少;随着高铁处理时间的延长,该基因表达量增多.新叶中的表达趋势与茎和成熟叶中的趋势正好相反.讨论了MxYSL7在小金海棠体内铁营养代谢中的作用.认为MxYSL7可能参与了体内铁在木质部和韧皮部的运输过程,并参与铁在体内的解毒过程.     

小金海棠×M9后代杂种鉴定及倍性分离分析

为选育矮化和耐缺铁的苹果砧木,配置了小金海棠×M9杂交组合,首先筛选M9纯合显性SSR分子标记并利用该标记鉴定小金海棠×M9的有性杂种后代,之后利用流式细胞术分析杂交后代中的倍性分离。结果表明:SSR标记CH02d12-160可作为鉴定杂种后代的特异标记。在1 285株小金海棠×M9实生苗中,有284株为有性杂种后代,其余1 001株为小金海棠无融合生殖后代,无融合生殖率为77.90%。在284株小金海棠×M9有性杂种后代中,138株的样品得到可靠倍性鉴定结果,其中2x、3x、4x和5x分别为5(3.62%)、21(15.22%)、63(45.65%)和49株(35.51%)。     

不同铁营养状态对小金海棠镉吸收的影响

采用非损伤微测技术对不同铁营养状态（正常供铁、缺铁和高铁）下苹果小金海棠（Malus xiaojinensis）水培苗根部镉吸收速率和植株不同部位镉含量进行了测定,并采用半定量RT-PCR研究MxIRT1在不同铁营养状态下的表达变化。结果表明：正常供铁培养条件下,小金海棠根部各区镉吸收速率有明显差异,分生区〉伸长区〉成熟区;缺铁培养条件下,小金海棠植株根部分生区和伸长区镉吸收速率明显增加,成熟区无明显变化,植株地上部和根部镉积累增加;高铁培养条件下,小金海棠植株根部分生区和伸长区镉吸收速率明显降低,成熟区无明显变化,植株地上部和根部镉积累减少。铁转运蛋白编码基因MxIRT1在不同铁营养状态下表达水平存在明显差异,推测铁营养可能通过调控基因MxIRT1的表达影响重金属镉的吸收。     

玉米肌动蛋白解聚因子ZmADF4基因克隆、转录活性及表达分析

【目的】克隆玉米肌动蛋白解聚因子4（ZmADF4）基因,并对其转录活性和表达模式进行分析,为探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考依据,也为玉米抵抗逆境胁迫研究提供潜在的基因资源。【方法】采用同源克隆技术克隆玉米叶片ZmADF4基因,运用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、保守结构域及二、三级结构;通过原生质体瞬时转化进行亚细胞定位;利用酵母自激活分析该基因转录活性,下载RNA-Seq数据分析其在不同组织中的表达特性,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同逆境胁迫下的表达情况。【结果】从玉米叶片克隆获得的ZmADF4基因,编码区（CDS）长度为420 bp,编码139个氨基酸残基,蛋白分子量为15.855 kD,理论等电点（pI）为7.66,属于亲水性蛋白,具有典型的植物ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin,主要定位于细胞质中。ZmADF4基因不具有转录自激活效应,且在根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮等组织中呈差异性表达,在茎、果皮和叶片中表达量较高。ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫及脱落酸处理均有响应,其中高温胁迫下,整体呈上调表达趋势,而低温胁迫和脱落酸处理下,整体呈下调表达趋势,干旱和高盐胁迫下则呈先上调再下调表达的趋势。【结论】ZmADF4基因属于ADF基因家族成员,不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控,还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。     

小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化

SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化,在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础,通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因,命名为Ta SnRK2.2,并提交到Gen Bank(登录号:KJ850253)。Ta SnRK2.2基因全长4 118 bp,由9个外显子和8个内含子组成,包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守,Ta SnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。Ta SnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 k D,理论等电点为5.45,含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了Ta SnRK2.2基因过表达载体,转化拟南芥,获得转基因植株,通过RT-PCR方法检测到Ta SnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探

【目的】研究UGT198基因是否参与调控烟草抗虫性,为未来探索其参与调控杨树抗虫性奠定基础。【方法】前期通过分析公共转录组数据发现PtrUGT198基因在杨树响应虫害的转录组中高调表达,对其进行生物信息学及进化分析。以107杨为材料,克隆UGT198基因,构建过量表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草获得过量表达转基因株系。通过棉铃虫饲虫试验初步验证UGT198基因是否参与调控抗虫性,分析UGT198基因在调控抗虫性中发挥的功能。【结果】PtrUGT198基因完整的ORF区为1440 bp,编码479个氨基酸,理论分子量为53.14 kDa,等电点为5.92,编码不稳定疏水性蛋白。PtrUGT198蛋白的二级结构α-螺旋占41.75%,β-折叠占14.61%,β-转角占7.10%,无规卷曲占6.53%。PtrUGT198蛋白不存在跨膜区,预测其不属于膜蛋白,为非分泌性蛋白,该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。同源序列对比结果显示PtrUGT198蛋白的C末端存在高度保守的植物次生产物糖基转移酶(Plant secondary product glycosyltransferase, PSPG)...     

毛竹PheDof4-1基因克隆及表达分析

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,由多基因共同编码,参与植物转录调控、生长发育及胁迫响应等生物学过程。以毛竹为研究对象,克隆了1个Dof基因,命名为Phe Dof4-1,基因长度为1 473 bp,推测其蛋白质产物的分子量是53.2 kDa,等电点为8.05。qRT–PCR结果显示,Phe Dof4-1在低温和250 mmol·L~(-1) Na Cl处理的幼茎中诱导表达,而在20%PEG8000处理的根中表达则受到强烈抑制,在叶片中不同处理条件下呈现不同的表达趋势。研究结果为Phe Dof4-1在非生物胁迫中的作用提供理论依据,为竹子分子育种提供参考。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定(摘要)(英文)

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其分别转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

淹水胁迫对湖北海棠叶片生理指标的影响及胁迫相关基因的表达

以湖北海棠1年生实生苗为研究对象,研究了淹水胁迫对其叶片生理指标的影响。结果表明:随着淹水时间延长,湖北海棠叶片可溶性糖、可溶性蛋白质量分数均显著高于对照组,并呈现逐步上升趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性先上升后下降,过氧化物酶(POD)先下降后上升,二者可能存在一定的补偿机制;脯氨酸(PRO)和丙二醛(MDA)含量均呈现先下降后上升的趋势。除可溶性糖外,其他生理指标的峰谷值出现的时间均为第10d,但各指标的启动时间不同,PRO与MDA在0~5d启动,SOD与POD以及可溶性糖在5~10d启动,可溶性蛋白在15~20d启动。通过荧光定量PCR检测水淹胁迫后胁迫相关基因的表达,初步认为MhWRKY1、MhWRKY40b和MhMYB121基因可能参与了湖北海棠响应淹水胁迫的响应。     

盐胁迫下拟南芥SCAMP基因克隆和表达的生物信息学分析

为探究分泌载体膜蛋白（Secretory carrier membrane protein, SCAMP）的功能,采用PCR方法从模式植物拟南芥中克隆到5个SCAMP基因,进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术分析5个SCAMP基因在盐胁迫下的表达模式。结果显示,拟南芥SCAMP蛋白的相对分子量为30.1~33.2 kDa,等电点为6.60~9.18,属于不稳定性疏水蛋白,二级蛋白结构中主要包含4种构象:α–螺旋（Alpha helix, Hh）、无规则卷曲（Randon coil, Cc）、直链延伸（Extended strand,Ee）和β–折叠（Beta turn,Tt）,其中以α–螺旋为主,包含4个跨膜结构域,N端和C端均在细胞膜内。实时荧光定量PCR结果表明,AtSCAMPs的表达量均受盐胁迫诱导上调表达,AtSCAMP1,AtSCAMP3,AtSCAMP4,AtSCAMP5基因在叶中的表达明显高于根,且AtSCAMP4和AtSCAMP5在叶中受盐胁迫变化最明显。     

‘白兰地’海棠不同花期与不同花器官的香气成分分析

【目的】探索‘白兰地’海棠（M.’Brandywine’）花香成分释放规律,为海棠芳香花育种和花香调控奠定基础。【方法】以香气浓郁的‘白兰地’海棠花朵鲜样为试材,采用固相微萃取与气质联用技术（SPME-GC-MS）分析不同花期和不同花器官的香气成分差异。【结果】（1）从大蕾期到盛花期分别检测出23、30、30、32种挥发性成分,其中叶醇、芳樟醇、己酸甲酯、乙酸叶醇酯、甲基庚烯酮和α-法呢烯为‘白兰地’海棠主要挥发性成分。花香总释放量呈现先上升后下降的趋势,在盛花期达到最高。香气成分种类构成主要以萜烯类（14.47%～37.30%）和醛酮类（21.64%～38.78%）为主,相对含量分别在盛花期和大蕾期达到最高,萜烯类相对含量在花朵开放过程中先上升后下降,而烷烃类和酯类呈现先下降后上升的趋势。对不同时期与挥发性成分之间进行了主成分分析,累计方差贡献率达87.64%,芳樟醇和壬醛分别在PC1正、负方向上贡献最大,分别与大蕾期和初花期呈高度正相关。（2）盛花期花朵花瓣、雌蕊（含花萼）和雄蕊中分别检测出28、32、25种挥发性成分。雌蕊总释放量最高,花瓣最低,对不同花器官与挥发性成分之间进行了...     

海棠‘比利时垂枝’McRGL1a基因的克隆与分析

[目的]DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路一类重要的调节因子,具有抑制植物生长的生理功能.本研究从海棠品种‘比利时垂枝’中分离得到一个海棠DELLA蛋白家族基因McRGL 1a,并对其基因进行生物信息学分析,为进一步研究McRGL 1a在调控植物株高的生物学功能奠定基础.[方法]通过RT-PCR技术获得McRGL 1a基因的cDNA.应用多种生物学工具分析其序列特征.[结果]序列分析表明,McRGL 1a的cDNA长度为1 920 bp,编码639个氨基酸;McRGL1a蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;海棠McRGL1a与苹果DELLA蛋白同源性极高,都具有DELLA、TVHYNP等典型结构;系统进化分析结果表明McRGL1a可能在植物株高调控过程中发挥重要功能.     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

珠眉海棠(Malus zumi Mats)盐应答MzSTO基因的克隆与表达分析

通过微列阵芯片(Microarray)分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到MzSTO (Salt tolerance protein)全长基因.结果表明:MzSTO基因cDNA全长1 066 bp,开放阅读框共729 bp,5'-UTR和3'-UTR的长度分别是49 bp和288 bp; MzSTO编码242个氨基酸,N端有2个保守的B-box锌指结构域(CX2CX8CX7CX2CX4HX8H);半定量RT-PCR表明MzSTO基因受到盐和干旱胁迫抑制,受冷处理诱导,并响应ABA(abscisic acid).以上结果表明MzSTO基因可能通过依赖ABA的途径参与非生物逆境胁迫.