苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用PlantCARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和InDel分布情况,共发现24个SNP位点和1个InDel,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。     

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用Plant CARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和In Del分布情况,共发现24个SNP位点和1个In Del,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。     

猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定

克隆了猪TCAP基因1 662 bp的启动子序列,序列分析发现其启动子区域存在Myo D、Myo G、MEF2转录因子结合位点,并构建了3个转录因子超表达载体,分别与TCAP基因启动子载体共转染PK细胞。结果表明,3个转录因子使TCAP基因启动子活性升高,均正调控TCAP基因的表达。     

鸭RIG-1启动子克隆、序列分析及在鸭胚胎期发育性表达

RIG-1属于细胞内蛋白,与细胞增殖、分化和天然抗免疫功能密切相关。为研究RIG-1在鸭胚胎期免疫器官发育中的作用,本研究克隆得到鸭RIG-1启动子并做生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR技术检测RIG-1基因以及预测得到的多个转录因子在鸭胚胎免疫器官发育过程中的表达模式。结果表明,扩增得到鸭RIG-1基因启动子4 372bp。序列分析表明,该基因启动子存在典型的TATA-box、CAAT-box调控元件,有IRF-1、RXR、RAR、AP1、NF-κB、SP1、IL6及Pax-2等多个转录因子结合位点。此外,RIG-1启动子预测发现了一个CpG岛,GC含量65.8%。定量结果发现,RIG-1在鸭胚胎免疫器官中表达呈动态性,具有不同的表达模式;并在法氏囊中的表达量高于脾脏和胸腺。聚类热图显示,只有在法氏囊中RIG-1与IRF-1、RXR、AP1、NF-κB、IL6的mRNA表达量具有相似的表达模式,这可能是由于在鸭胚胎期法氏囊具有较为完整的结构与功能,暗示它们可能为RIG-1的转录因子;而在法氏囊、脾脏和胸腺中,RIG-1与IRF-1、NF-κB基因都有较为相似的表达模式,在3个组织当中均被聚类在一起,说明IRF-1和NF-κB可能参与调控RIG-1的表达。研究结果为探索鸭RIG-1基因转录调控、表达,与在细胞增殖、分化、天然抗病毒免疫方面的功能提供了依据和方向。     

转录因子Sp1对成肌细胞中猪SKIP的表达调控作用

利用基因组PCR步移方法获得猪SKIP转录起始位点上游2 075 bp启动子序列。生物信息学分析发现该序列中存在4个Sp1结合位点和1个CpG岛。将启动子序列构建到pGL3-basic的双荧光素酶报告基因载体上,再利用RNA干扰技术分析转录因子Sp1对SKIP转录的影响。荧光素酶活性分析发现Sp1的表达抑制使成肌细胞中SKIP启动子活性显著下降,表明转录因子Sp1可能通过顺式作用元件GC-Box对成肌细胞分化过程中SKIP基因的转录激活起正向调控作用。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

鸭MyoG基因启动子的生物信息学分析及其甲基化频率对基因表达的影响

采用RT–PCR技术扩增和克隆鸭Myo G基因启动子,并对其启动子序列进行生物信息学分析,采用Sequenom Mass Array技术检测Cp G岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平,用q RT–PCR检测Myo G基因的表达量。结果表明,扩增得到鸭Myo G基因启动子序列2 730 bp,对启动子序列预测后,发现存在2个Cp G岛,其中Cp G岛(–2 536~–1 997 bp)存在5个转录因子结合位点和多个真核生物结构元件。甲基化检测结果表明:在鸭的个体和组织水平上,启动子甲基化率均未聚类在一起;Cp G位点甲基化频率存在个体差异,22%Cp G位点的甲基化频率与Myo G的m RNA表达量呈负相关(P0.05),78%Cp G位点的甲基化频率呈正相关(P0.05),其中,腿肌甲基化位点Cp G_1、Cp G_26.27.28.29的甲基化频率与Myo G基因表达水平均呈显著相关(P0.05)。Myo G基因在鸭与在哺乳动物中的转录调控机制存在差异。试验中发现多个影响鸭Myo G基因转录的潜在甲基化位点,其中Cp G_1与Cp G_26.27.28.29能通过DNA甲基化修饰影响Myo G基因在鸭腿肌中的转录。本研究结果可为鸭Myo G基因转录调控提供参考依据。     

鸭IL-2基因启动子的克隆、多态性与表达的关联分析

为研究鸭IL-2基因调控区单核苷酸多态性对其转录调控的影响,克隆获得了鸭IL-2基因启动子2 850 bp序列,与人、小鼠和原鸡的同源性分别为35.37%,37.52%和34.74%。其中,-1 400/-1 000存在集中的核心转录因子结合位点。对鸭IL-2基因启动子(-1 932/-742)进行单核苷酸多态检测和遗传多态性分析发现,该区域存在两个突变位点(C-1353A、C-1406T),且均处于Hardy-Weinberg极不平衡状态;等位基因A均为优势等位基因。单核苷酸多态与其表达水平的相关性分析发现,突变位点不同基因型与IL-2基因mRNA表达水平和IL-2蛋白水平均无显著相关关系,但基因型AA个体的mRNA表达量均高于其他基因型个体(P>0.05),表明鸭IL-2启动子等位基因A可能有促进IL-2基因转录的趋势。研究结果为IL-2基因转录调控机制的研究提供了理论基础。     

真核生物启动子TATA-box·GC-box和CAAT-box的分析

下载了已经通过试验证实的2 541条真核生物启动子序列,运用生物信息学方法分析了TATA-box、GC-box和CAAT-box的数量及其在启动子中的分布情况。结果表明,有23.85%真核生物启动子序列中至少有1个TATA-box,且TATA-box主要分布在转录起始位点前24~36 bp的区域内;有47.30%真核生物启动子序列中至少有1个GC-box,且GC-box在转录起始位点前23~128 bp的区域内分布比较集中;有42.35%真核生物启动子序列中至少有1个CAAT-box,且CAAT-box在转录起始位点前51~159 bp的区域内分布比较集中。这说明TATA-box在真核生物启动子中的位置比较固定,对基因转录的正确起始可能起着重要的作用;而GC-box和CAAT-box分布区域较广,数量也明显多于TATA-box。     

灵芝漆酶基因转录Cu~(2+)诱导特性及其启动子的克隆与序列分析

以Cu2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基冈的转录特性,并对其启动子进行了克隆及序列分析.研究发现:灵芝漆酶基因在cu2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加3.0 mmol·L-1Cu2+、诱导时间为6 d时,漆酶基因的mRNA表达量最高.根据GenBank中已报道的灵芝漆酶基冈的序列信息,经PCR扩增获得了灵芝漆酶5'端长879bp的基凶特异序列,进而通过self-tbrmed adaptor PCR(SEFA-PCR) 方法,扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域除分布有TATA-box、CAAT-box及GC-box等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元什序列位点,包括4个MRE元件、4个STRE元件、11个HSE元件和5个氮因子结合位点等.     

江口萝卜猪UCP2基因启动子变异分析

[目的]研究江口萝卜猪UCP2基因启动子变异,并对其进行生物信息学分析,为江口萝卜猪品种选育及开发利用提供理论依据.[方法]利用江口萝卜猪基因组DNA构建混合DNA池,PCR产物直接测序后采用DNASTAR等生物软件分析筛选出SNP位点,然后采用Neural Network Promoter Prediction、TFsitescan、WebGene等生物信息学分析软件预测单核苷酸突变前后的UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点和CpG岛.[结果]在江口萝卜猪UCP2基因启动子上共筛选到3个SNPs位点,分别是G-84>A、G-161>C和T-366>A.利用生物信息学分析软件分析单核苷酸突变对UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点及CpG岛的影响,结果发现,从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到的3个SNPs位点均不在预测到的启动子核心区域,但靠近转录起始点;3个SNPs位点也不在预测得到的CpG岛内,且不会影响UCP2基因启动子的甲基化水平;3个SNPs位点能在不同程度上导致转录因子结合位点消失或产生新的转录因子结合位点,其中G-161>C突变对转录因子结合位点的影响最大.[结论]从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到3个SNPs位点,分别为G-84>A、G-161>C和T-366>A,虽然这3个SNPs位点均不在启动子核心区域及CpG岛内,但不同程度造成转录因子结合位点消失或产生,其中G-161>C的影响最大,可能是调控UCP2基因表达的重要功能突变位点.     

水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。     

酵母单杂交文库构建及巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子筛选

[目的]利用酵母单杂交文库筛选巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子,挖掘参与调控葡萄开花时间的因子,为揭示花期转变代谢通路和定向改良葡萄品种提供理论参考.[方法]利用PlantCARE分析预测VvFT基因启动子顺式作用元件,并以VvFT基因启动子为诱饵,利用酵母单杂交文库筛选技术,筛选作用在VvFT基因启动子上游的调控因子.[结果]葡萄VvFT基因启动子区域存在13种启动子顺式作用元件,包括A-box、CAAT-box和TATA-box组成型调控元件;光响应调控元件ATC-motif、Box 4、G-Box和GT1-motif;茉莉酸甲酯(MeJA)响应调控元件CGTCA-motif和TGACG-motif;干旱诱导的MYB结合位点元件MBS;玉米蛋白代谢必需的调控元件O2-site;参与生物钟控制的调控元件circadian;厌氧诱导必需调控元件ARE.以VvFT基因启动子为诱饵,筛选获得34条表达序列标签(EST),其中有21条为未知功能,有13条在植物生长、抗逆防御、信号转导、转录调控、蛋白酶等方面均有已知或预测的功能,包括转录抑制因子ft41、GRF1互作因子ft44、NAP1相关蛋白ft64及ft70分子伴侣DnaJ10.酵母单杂交点对点验证结果表明VvDnaJ10和VvFT基因启动子之间有相互作用.[结论]通过酵母单杂交文库筛选获取13条候选EST,虽然大部分EST功能预测分析结果与VvFT调控开花时间无明显的直接关系,但研究结果为进一步探索VvFT转录或表达水平控制葡萄开花时间的分子机制提供侯选基因.     

牛SOCS5基因5'调控区多态性研究

[目的]筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响.[方法]选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响.[结果]牛SOCS基因5调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点.生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平.[结论]牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点.     

牛BMP15基因5''''UTR区克隆及生物信息学分析

研究克隆了牛BMP15基因5'UTR区1 350 bp的基因组序列,利用promoter在线工具分析发现,在扩增片段的255～305 bp 处存在可能的启动子位点;利用TFSEARCH在线程序发现该段序列上有35个评分在90分以上的潜在的转录因子结合位点,其中评分在95分以上的有5个.在这些转录因子的结合位点中,部分与启动子有关(如GC-box等),但没有发现对转录有重要调控作用的TATA-box.     

鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析

文章采用基因定点突变和报告基因技术作A/T富集区启动子鉴定和转录调控分析,研究鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区是否具有启动子活性。PromPredict预测分析提示miR-17-92基因簇上游-388～-444 bp处可能是启动子区域。转录因子结合位点分析发现,A/T富集区存在3个E2F1潜在结合位点,分别位于miR-17-92基因簇上游-1 273 bp(结合位点1)、-1 186 bp(结合位点2)和-753 bp(结合位点3)处。报告基因活性分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区具有启动子活性,其中miR-17-92基因簇上游-440/-1区域启动子活性最强。共转染分析显示,转录因子E2F1极显著抑制该A/T富集区启动子活性(P<0.01);进一步定点突变分析表明E2F1通过E2F1结合位点1和2抑制A/T富集区启动子活性。报告基因分析发现,与对A/T富集区启动子作用不同,E2F1促进miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子活性。文章首次发现鸡miR-17-92基因簇上游存在一个新的转录调控区,对揭示鸡miR-17-92基因簇转录调控具有重要意义。     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

猪LPAR3基因克隆及其在子宫内膜细胞的表达

【目的】获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构,研究其启动子活性;探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。【方法】应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列;预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛,构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体,与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞,检测启动子活性;应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量;应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。【结果】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp,CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650bp)的5'调控序列,分析预测显示该调控区不存在TATA box,存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点,且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示,启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高,其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示,妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量,且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量,LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。【结论】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达,显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。