鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测

首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。     

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒P30-54融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及反应原性研究

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。     

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白的免疫原性评估

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3⁺T细胞百分比显著增加,CD4⁺/CD8⁺T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。     

猪瘟病毒囊膜蛋白在杆状病毒表面的展示及展示蛋白的免疫原性试验

【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后在昆虫细胞膜上表达了重组E0E1E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠血清OD450值达到1.82;血清中和试验表明,免疫小鼠的血清50%中和效价(PD50)达到512。【结论】成功构建了表面展示猪瘟囊膜蛋白的重组杆状病毒。     

人TIMMDC1基因在杆状病毒系统中的表达

旨在杆状病毒系统中表达TIMMDC1/c3orf1(Translocase of inner mitochondrial membrane domain containing l)基因,为其应用和功能研究奠定基础.将TIMMDC1基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染Bm-N细胞,Western blotting验证蛋白的表达.结果表明,重组克隆质粒pFastBac 1-GFP-TIMMDC1的两两酶切结果证实重组克隆质粒构建正确.PCR结果显示重组穿梭质粒Bacmid pFastBac1+ TIMMDC1+GFP可扩增出目的条带.Bm-N-rBacTIMMDC1的表达产物经Westem blotting分析,分别可见相对分子质量57kD的特异蛋白条带,表明融合蛋白TIMMDC1 +GFP在家蚕Bm细胞中成功的进行了表达.本研究成功在杆状病毒表达系统中表达了TIMMDC1基因,为其临床应用和功能研究奠定了基础.     

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.     

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在Sf9昆虫细胞中的表达

【目的】在Sf9昆虫细胞中表达H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)基因。【方法】用PCR方法克隆H5N1亚型AIVNA基因,定点插入到转移载体pFastBacHTb中,构建重组转移载体pFastBacHTb-NA。将其转化到含有AcBacmid和helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞中,与AcBacmid重组,获得rAcBacmid-NA。提取重组的Bacmid,转染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒vAc-NA。将vAc-NA重新感染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,3~5 d后收集被感染细胞。取转染细胞、感染细胞、破碎感染细胞上清和破碎感染细胞沉淀进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。【结果】通过PCR成功地克隆了1 352 bp的H5N1亚型AIV不含信号肽序列的NA基因;pFastBacHTb-NA和rAcBacmid-NA构建成功。AIVNA基因在昆虫Sf9细胞内得到有效表达,表达产物分子质量约为52 ku,且具有免疫原性。【结论】H5N1亚型AIVNA基因在昆虫Sf9细胞中表达成功。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测

利用杆状病毒表达系统进行Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表达研究。首先通过PCR方法扩增出3C基因,亚克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,获得重组转座载体p FB-3C,随后将该重组质粒转化感受态细胞DH10Bac进行同源重组,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,获得重组杆状病毒穿梭质粒r Bacmid-3C,将其在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac-3C,并进行重组蛋白表达的检测。间接免疫荧光结果,鸭抗全病毒阳性血清能够与重组蛋白发生特异性结合。结果表明,DHAV-Ⅰ3C蛋白在sf9昆虫细胞中获得了成功表达。     

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。     

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析

【目的】为获得禽戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）中国分离株（CaHEV）ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析。【方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA 结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot 和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74-88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74-88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。     

猪瘟病毒E~(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

介导分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型 ORF2 基因插入供体质粒pFastBac^TMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代 ORF2 原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Western-blot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达.     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

 【目的】口蹄疫病毒（FMDV）对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual 中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf 9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒Bac mP12A3C和Bac P12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30 nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白(N)在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的观察

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV )核衣壳蛋白N 基因,将其克隆入杆状病毒供体质粒 pFastBacTM Dual,pFastBacTM Dual-N转入DH10Bac菌中进行同源重组,经三重抗性和蓝白斑筛选,得到重组质粒 Bacmid-N,将其转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-N.通过间接免疫荧光试验检测显示,重组蛋白在昆 虫细胞中得到表达.体外组装TGEV病毒样颗粒(VLPs)试验表明,rBac-N 单独感染sf9细胞未见形成明显的病 毒样颗粒,昆虫细胞内只观察到杆状病毒粒子.试验结果为探讨TGEV 核衣壳蛋白在病毒装配过程中的作用提 供了依据.     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。