猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。     

荷斯坦奶牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC检测方法建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦奶牛瓜氨酸血症(CN)的分子检测方法,根据CN是由于精氨酸琥珀酸(ASS)合成酶第86位精氨酸突变为终止密码子的遗传学基础,设计了1对引物对3种不同基因型的基因材料PCR扩增,利用Navigator software软件分析确定检测温度、洗脱浓度及梯度等条件,建立检测方法。对55份进境荷斯坦奶牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物送测序,结果与DHPLC检测结果一致。研究表明,该方法可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征的检测,是一种有效的新方法。     

荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征PCR-DHPLC检测方法建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形综合征(Complex vertebral malformation,CVM)变性高效液相色谱(DHPLC)的分子检测方法,根据CVM是由于SLC35A3基因第4外显子559位处发生G→T突变的遗传学基础,设计了1对引物对3种不同基因型的基因材料PCR扩增,利用Navigator软件分析确定检测温度、洗脱浓度及梯度等条件,建立检测方法。对55份进境荷斯坦奶牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物送测序,结果与DHPLC检测结果一致。研究表明,PCR-DHPLC是一种可有效用于荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征检测的新方法。     

鸭瘟病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

为了快速、准确诊断和防制鸭瘟疫病,试将PCR技术和变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合建立新的诊断方法,对鸭瘟进行诊断。结果表明:PCR-DHPLC技术是一种快速、高敏感性、高特异性的检测方法。     

荷斯坦牛瓜氨酸血症焦磷酸测序检测方法的建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦牛瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)分子检测方法,依据CN是由于精氨酸琥珀酸(ASS)合成酶基因编码第86位精氨酸的密码子突变为终止密码子的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析。用建立的方法对55份进境荷斯坦牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行常规测序,结果与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法可用于荷斯坦牛瓜氨酸血症的检测,是一种有效的新方法。     

东方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用

为建立检测东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)的方法,本研究利用PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),针对EEEV NS1基因,设计特异性引物,通过优化反应条件,对核酸扩增产物采用DHPLC进行检测分析,核酸扩增产物形成DHPLC特征峰图,建立了EEEV的PCR-DHPLC快速检测方法。结果显示该方法与其他6种常见马病病毒均无交叉反应,未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰,具有较强的特异性;对梯度稀释的标准阳性模板的检测限可达到10拷贝/μL;利用本研究建立的方法与荧光定量RT-PCR对30份临床样品进行检测,两者符合率达100%。本研究建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可以用于EEE的病原学诊断及流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR-DHPLC检测新技术的建立及应用

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,根据PRRSV GP5基因的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。以猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪流感病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应,具有较好的特异性和重复性;对阳性标准品的检测结果表明,所建立的PCR-DHPLC法灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。对16份疑似病料分别应用本试验所建立的PCR-DHPLC法与SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法、病毒培养法进行检测,发现有15份荧光定量PCR阳性,15份PCR-DHPLC阳性,12份PCR-凝胶电泳阳性。结果表明,建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

鹅细小病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

为建立一种敏感、自动化,高通量的检测病料中鹅细小病毒（GPV）的PCR-DHPLC检测方法,本研究首先根据GenBank上GPV标准毒株VP3基因序列设计一对引物,建立检测GPV的PCR方法,然后将PCR检测方法与DHPLC法进行有机结合,建立了GPV PCR-DHPLC检测方法。以GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液进行特异性试验,结果无交叉反应,表明该检测方法具有较高的特异性。对GPV阳性样品检测结果表明该方法的敏感性较高,是常规PCR电泳法的100倍,且具有较好的重复性。对临床上采集的100份疑似病料,分别应用PCR电泳法和本试验建立的PCR-DHPLC方法进行检测,结果阳性符合率为100%。表明该方法具有特异、敏感、快速、重复性好、可高通量检测等优点,可用于临床样品的大批量检测。     

变性高效液相色谱高通量检测动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌

应用复合PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,通过通用增菌培养,建立动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的快速高通量检测方法.根据沙门氏菌和志贺氏菌特异基因序列分别设计特异性引物,复合PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测.以49株参考菌株做特异性试验,并开展了精密度检测试验.试验结果表明,该方法具有很好的特异性和精密度,经通用增菌和复合PCR-DHPLC技术可同时检测饲料中的沙门氏菌和志贺氏菌.该方法可以快速、准确、高通量检测,是动物源性饲料中致病菌高通量检测的新技术.     

荷斯坦奶牛CN和DUMPS遗传缺陷病的巢式PCR检测方法的建立和应用

为建立荷斯坦奶牛瓜氨酸血症和尿苷酸核酶缺乏症两种遗传缺陷病的检测方法，根据文献报道的精氨酸琥珀酸合成酶、UMPS基因核苷酸序列，设计引物，通过条件的优化，建立了巢式PCR反应体系。结合PCR产物测序，建立了检测CN和DUMPS方法。取243份临床牛血清样品用巢式PCR检测并测序，发现CN野生型238份，CN杂合子型5份，CN突变型0份；DUMPS野生型236份，DUMPS杂合子型5份，DUMPS突变型2份。所建立的巢式PCR方法灵敏、特异，还兼具高通量的特点，适合口岸对荷斯坦奶牛CN和DUMPS遗传缺陷病的大样品量检测。     

对虾白斑综合症病毒变性高效液相色谱检测方法的建立与应用

据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。     

多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核致病菌群并同步鉴别致病菌种

本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102～103基因拷贝或3.6～6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法,所建立的四重PCR-DHPLC方法能实现快速检测结核分枝杆菌复合群并鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌     

PCR结合变性高效液相色谱法与荧光定量PCR法在检测禽白血病中的比较与应用

本研究旨在比较PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)与荧光定量PCR(Real-time PCR)两种方法在检测禽白血病中的应用。根据禽白血病pol基因序列,设计1对引物和1条探针,利用引物进行禽白血病模板的RT-PCR扩增,产物经变性高效液相色谱上样处理;利用引物及探针进行荧光定量PCR扩增,结果与PCR-DHPLC进行比对。两种方法同时用正常鸡胚尿囊液、鸭瘟病毒、传染性支气管炎病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒做特异性检测;以稀释成不同梯度的AV228毒株核酸做敏感性检测。试验结果表明PCR-DHPLC方法只对禽白血病病原有阳性扩增的吸收峰,Real-time PCR也只对禽白血病病原有阳性扩增,两法均对其他禽源病毒核酸无特异性扩增;PCR-DHPLC与Real-time PCR法相比,灵敏度虽低于Real-time PCR 1个数量级,但检测限仍可达到3 pg核酸模板。两种方法均能检测到感染鸡的泄殖腔拭子所采集的病毒量。采集120份蛋鸡棉拭子同时进行临床检测,两种方法检测ALV的符合率为100%(15/120)。研究表明两种方法均可用于诊断禽白血病病毒。     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒(CCV)蛋白激酶(PK)基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明:建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。     

浦东地区犬皮肤病原真菌PCR检测结果及分析

本文利用建立犬、猫真菌性皮肤病常见病原体PCR检测方法,对浦东地区部分诊所收集的犬真菌性皮肤病病原体进行多重PCR检测,在第一批9个样品中,2个样品(1号和6号)均扩增出犬小孢子菌目的片段290bp,3个样品(3、8号和9号)扩增出马拉色菌的目的条带580bp,经过测序验证正确。这为构建宠物皮肤病诊治技术体系提供可靠的技术支撑。     

饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测方法的建立

以鸡组织为材料,提取鸡组织的线粒体DNA,以鸡12SrRNA基因为靶基因设计引物,PCR反应扩增片段230bp;用13种畜禽和水产动物线粒体DNA验证该PCR引物的特异性,结果只有鸡线粒体DNA为阳性;PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04mg/L;在随机采集的22份饲料样品中,检出8份鸡源性成分样品。结果表明,本研究建立的PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地对饲料中的鸡源性成分进行快速准确检测。     

应用多重GeXP-PCR同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的研究

拟建立一种基于GeXP多基因表达分析系统的多重PCR方法,同时检测6种鸡免疫抑制病病毒——鸡马立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亚群)、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。多重PCR反应使用嵌合引物和通用引物组合的反应体系,经过GeXP多基因表达分析系统进行毛细管电泳,鉴别PCR产物片段;通过调整嵌合引物浓度、Mg~(2+)浓度、Taq酶浓度优化反应体系及调整退火温度和时间优化反应条件。应用建立的多重GeXP-PCR,分别单独和同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的8个目的基因,同时以其他常见禽类病毒和鸡组织器官核酸为对照,验证其特异性;检测8个目的基因不同浓度的克隆质粒,验证其敏感性;应用建立的多重PCR检测300份临床样品,并同时用荧光定量PCR和测序验证其检测结果的准确性。结果表明建立的多重GeXP-PCR方法能够分别扩增出6种病毒,8个特异性目的片段,不能扩增其他常见禽类病毒和鸡组织器官的基因;在低至100copies·20μL~(-1)的水平能同时特异性地检测出6种鸡免疫抑制病病毒核酸;检测300份临床病死鸡样品,190份样品显示为阳性,PCR和测序结果与多重GeXP-PCR结果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特异、敏感、高通量地检测6种鸡免疫抑制性病毒,可用于临床鉴别诊断和分子流行病学调查,具有很高的临床应用价值。     

变性高效液相色谱技术鉴别猪牛源性成分的试验

建立了检测动物源性食品中猪、牛成分的PCR结合变性高效液相色谱技术,为牛、羊成分的鉴别提供一种新的分子诊断技术。以猪、牛的线粒体DNA为靶基因,设计特异性PCR引物。双重PCR扩增后,DHPLC分析。经优化DHPLC最佳条件为:使用PS-DVBC18 DNASep色谱柱(4.6 mm×50 mm,粒度3μm),设定50℃柱温,起始流动相为:45%缓冲液A和55%缓冲液B,流速0.9 m L/min;上样量:PCR产物5μL。结果表明:DHPLC法具有良好的特异性,仅能检出猪、牛源成分,而与羊、鸡、鸭源成分无交叉反应;方法的灵敏度可以达到1 000 copies核酸。     

柑橘黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

【目的】本研究旨在建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑橘黄龙病的高效简便检测方法。【方法】以黄龙病菌株psy62的保守基因序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系。经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑橘样品的黄龙病菌检测,验证RPA检测体系的适用性。【结果】建立了黄龙病菌的RPA检测方法。(1)特异性：能特异性检测柑橘黄龙病。(2)灵敏度：RPA是PCR的100倍,与实时荧光PCR相当。(3)检测体系：只需20min,大幅提高检测效率。(4)适用性：RPA与实时荧光PCR检出率均为35.63%,比PCR的31.03%略高。【结论】建立了黄龙病菌的RPA检测方法,具有特异性强、灵敏度高、检测快速、无需特殊仪器设备和操作简便等特点,为柑橘黄龙病提供了高效简便的快速检测手段。