猪精子获能、顶体反应及冷休克对顶体酶抑制剂的影响

为了探究猪精子在获能、顶体反应及冷休克处理后对精子顶体酶抑制剂表达量的影响,以及顶体酶抑制剂在精子中何时被降解,低温是否会损伤顶体酶抑制剂,利用SDS-PAGE、Western blot分析射精精子、获能精子、顶体反应精子和冷休克精子组的总蛋白种类及猪精子顶体酶抑制剂表达量的变化。结果显示:射精精子处理组与获能精子、顶体反应精子处理组的顶体酶抑制剂表达量差异显著(P<0.05),且获能和顶体反应处理组间的差异不明显(P>0.05);射精精子与冷休克精子处理组的顶体酶抑制剂表达量差异极显著(P<0.01),且冷休克处理组的顶体酶抑制剂出现异常表达。推测:精子在获能或顶体反应期间,顶体酶抑制剂可能通过泛素-蛋白酶体途径被降解,释放出有活性的顶体酶;低温可能导致顶体酶抑制剂蛋白结构的改变或损坏,导致其表达量异常。     

泛素结合酶抑制剂对猪精子获能状态及精卵结合能力的影响

本研究旨在探究猪精子获能处理对精子蛋白泛素化水平的影响以及添加泛素结合酶(E2)抑制剂NSC697923对精子蛋白泛素化水平和精卵结合能力的影响。实验设6个处理,即空白对照组(未添加任何试剂)、阴性对照组(添加DMSO)和4个NSC697923处理组(5、10、15、20μmol/L NSC697923)。通过Western blotting方法定量分析获能精子的泛素化水平以及抑制泛素化后精子的获能水平;采用Hoechst染色法检测NSC697923处理组精子与成熟卵母细胞共孵育6 h后精子的黏附率。结果表明:猪精子获能后精子蛋白的泛素化水平显著高于鲜精组;NSC697923处理组未能检测到精子获能状态;NSC697923处理组精子黏附率显著低于对照组。综上表明,泛素-蛋白酶体系统是猪精子获能过程必不可少的一环,获能伴随着精子蛋白泛素化水平上调,抑制泛素化后精卵结合能力下降,据此提出把精子蛋白泛素化作为检测精子获能标志的可能性,但仍需要进一步验证。     

获能处理对猪精子质量及泛素对顶体酶抑制剂水平调控的影响

【目的】探究猪精子体外获能前后顶体酶抑制剂(AI)表达量以及AI的泛素化水平的变化,了解AI与泛素-蛋白酶体系统(UPS)间的联系,为深入研究泛素-蛋白酶体途径(UPP)在猪精子获能过程中的作用提供参考。【方法】选择18～24月龄的成年健康长白公猪,使用手握法采集公猪精液,将一部分精子进行获能处理,一部分作为对照(鲜精),使用计算机辅助精子分析系统(CASA)、低渗肿胀法(HOST)、考马斯亮蓝染色、Western blotting和锌离子(Zn²⁺)标记检测获能前后精子的动力学参数、质量参数、酪氨酸磷酸化水平和Zn²⁺含量;Western blotting检测获能前后精子中AI和泛素(Ub)的表达量;免疫荧光法检测AI和Ub在精子中的定位;免疫共沉淀分析AI和Ub的结合情况。【结果】与新鲜精子相比,获能精子动力学参数VSL和BCF极显著升高(P<0.01),获能精子的活力、质膜完整性、顶体膜完整性、活率均极显著降低(P<0.01);获能精子蛋白酪氨酸磷酸化水平极显著升高(P<0.01),Zn²⁺极显著...     

鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

旨在探究鸽蛋低密度脂蛋白(LDL)对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响。试验分为5组,分别是鲜精组、3%LDL(-80和-196℃)处理组、9%LDL(-80和-196℃)处理组。采用CASA系统分析不同处理组添加不同浓度鸽蛋LDL对冷休克及冻融前后猪精子生物学性状的影响;通过SDS-PAGE、Western blotting、PCR扩增检测分析HSP70蛋白及凋亡基因表达量的变化。结果表明:猪精子经过冻融处理后,热休克蛋白HSP70的表达量高于鲜精组,同时添加9%鸽蛋LDL并置于-196℃保存的冻融精子的热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异(P0.05);在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l试验中,鲜精组的基因表达量均高于其他处理组,添加9%LDL(-196℃)处理组的基因表达量与鲜精组无显著差异(P0.05);在促凋亡基因Bak试验中,鲜精组的基因表达量最低,且添加9%LDL(-196℃)处理组的Bak基因表达量与鲜精组无显著差异(P0.05)。添加鸽蛋LDL可在一定程度上降低猪精子在冻融过程中造成的损伤,维持猪精子正常生物学性状,提高猪精子存活率。     

不同获能条件对猪精子体外获能和体外受精的影响

探讨猪精子在mTBM和TALP中分别获能2、3、4、5h和6h对体外获能的影响,并研究最适获能时间的精子体外受精的效果。结果表明:随着获能时间的延长,猪精子顶体反应率逐渐升高、质膜完整性逐渐下降,获能6h时的顶体反应率显著高于其他时间组,分别为52.5%和50.8%(P<0.05);质膜完整性显著低于其他时间组,分别为30.5%和31.4%(P<0.05);可获能4h的超激活运动率显著高于其他时间组,分别为56.6%和54.5%。将鲜精与冻融的精子获能4h后与成熟的猪卵母细胞进行体外受精,mTBM处理组的卵裂率显著高于TALP,分别为42.7%与40.2%和35.9%与33.4%,但鲜精与冷冻精液组间差异不显著。     

泛素-蛋白酶体系统对精子获能的作用

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)参与了许多精子相关的获能和受精过程,并在获能和受精中起到一定作用。本文综述了精子获能过程中UPS的参与以及发生的相关变化,包括一系列已知的蛋白酶体相关的精子蛋白,并讨论了这些蛋白质与蛋白酶体之间的关系。蛋白酶体抑制剂能显著改变获能并阻止顶体反应,26S蛋白酶体降解AKAP3部分调节导致获能的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的释放。此外,在整个获能过程中,20S核心亚基的定位和丰度发生变化。     

卵母细胞ZP蛋白及其泛素化的研究进展

卵透明带(ZP)是包围在卵母细胞外的糖蛋白基质,在受精过程中的精卵识别及顶体反应中都起着十分重要作用。研究证实,泛素化蛋白质存在于哺乳动物的ZP上,而泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白降解又是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。因此,在受精过程中,精子顶体和成熟卵母细胞释放蛋白酶体,有可能通过泛素-蛋白酶体途径降解ZP中的泛素化蛋白。文章主要对卵母细胞ZP的结构和功能及泛素-蛋白酶体途径参与受精过程作一综述。     

枸杞多糖对获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力的影响

为探究枸杞多糖(LBP)对猪精子获能过程中抗氧化功能的影响,用不同浓度LBP(2、4、8和16 mg/mL)处理获能过程中的猪精子,测定精子活率、线粒体活性、顶体完整率和质膜完整性,筛选出最适LBP浓度,进一步测定最适浓度下的抗氧化指标。另外,以氧化激动剂氯化镉孵育猪精子后,用RT-qPCR方法分析SOD-1和Caspase-8处理前后的相对表达量。结果表明:LBP浓度分别为2 mg/mL和8 mg/mL时,鲜精和冻精质量较空白组显著提高(P0.05)。鲜精和冻精获能试验组总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性较获能空白组显著增加(P0.05),丙二醛含量差异不显著(P0.05)。加氯化镉诱导氧化应激后,新鲜精子和冻后精子获能试验组较获能空白组SOD-1 mRNA表达量均显著上调(P0.05),Caspase-8 mRNA表达量显著下调(P0.05)。结论:添加LBP能够在一定程度上提高获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力。     

泛素激活酶抑制剂对猪精子获能状态、膜重构及体外受精的影响

【目的】评估泛素激活酶(E1)对猪精子获能、膜重构和体外受精的影响。【方法】选取5头长白猪采集精液,以硫醇酯法评估泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme, E1)抑制剂(TAK-243)对精子中泛素(ubiquitin, Ub)与E1结合的影响;将精子分为鲜精组(Fresh)、DMSO组(DMSO)、获能组(Capacitated)及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组,鲜精组用2 mL PBS重悬精子沉淀;获能组用2 mL获能液重悬精子沉淀;DMSO组及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组分别用2 mL含0.07%DMSO及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243的获能液重悬精子沉淀,使用微生物动(静)态图像检测系统检测精子的动力学参数;以Western blotting法检测精子的酪氨酸磷酸化水平;Zn²⁺荧光探针检测精子的Zn²⁺含量;花生凝集素染色检测精子的顶体膜重构;免疫荧光法检测顶体表面精子黏附蛋白(AQN-1、AWN)的表达;体外受精法检测TAK-243...     

蛋白酶体在精子获能和受精中的作用

26S蛋白酶体是一个多亚基蛋白酶,在人、鼠、猪、牛、海鞘和棘皮动物受精研究中,表明它是一种特异性的靶蛋白。在研究哺乳和非哺乳动物物种受精过程中发现蛋白酶体的位置,蛋白酶体和精子移动有关,蛋白酶体与透明带(zona pellucida,ZP)结合促进顶体胞吐,精子泛素化和蛋白水解酶抑制剂有助于阻碍精子多精入卵,蛋白酶水解被抑制改变精子获能进程,精子表面结合腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的消耗阻碍猪和棘皮动物受精,蛋白酶体水解抑制剂阻碍精子穿过ZP,但是不改变哺乳动物精子和卵子结合的效率,不改变和精子有关的去泛素化活性和体外受精(in vitro fertilization,IVF)时单精受精和多精受精的平衡。总的来说26S蛋白酶体与人和动物受精的诸多事件有关,为精子和卵子结合机制的研究提供理论依据。     

猪精子获能前后细胞亚组分蛋白分离及酪氨酸磷酸化蛋白的鉴定

本研究对猪精子获能前后细胞亚组分蛋白进行分离以及对酪氨酸磷酸化蛋白进行鉴定,旨在为哺乳动物精子受精生物学研究奠定理论基础。利用动物精子体外获能培养、细胞亚组分分离技术及蛋白免疫印迹的方法,分离猪精子细胞亚组分蛋白及酪氨酸磷酸化蛋白鉴定。结果表明,猪精子经过获能培养后各项活力指标均得到显著提高,且与精子蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰密切相关;获能精子中126、108、79ku的高分子量蛋白磷酸化程度明显高于未获能精子;分子质量约为25、47、50ku的膜蛋白及47ku胞浆蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中25、47ku的膜蛋白酪氨酸磷酸化程度显著高于未获能精子(P<0.05);分子量约为23、37、42～50ku的核蛋白发生酪氨酸磷酸化,获能精子中23ku的核蛋白酪氨酸磷酸化程度显著高于未获能精子(P<0.05)。结果提示,猪精子细胞不同亚组分中,发生酪氨酸磷酸化修饰的蛋白以膜蛋白及核蛋白为主,同时有少量的胞浆蛋白。     

钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化调节作用研究

钙离子(Ca2+)参与哺乳动物精子获能、超激活运动和顶体反应等多个生理过程,但其作用机理尚未明确。本研究旨在探讨Ca2+在猪精子获能过程中对精子活力和蛋白磷酸化的影响及其作用机制。采用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)及蛋白免疫印迹方法测定不同Ca2+浓度处理后精子活力参数及蛋白磷酸化水平变化,同时,利用细胞免疫荧光技术对不同处理组精子样品磷酸化蛋白进行细胞亚组分定位。CASA结果显示,随着Ca2+浓度增加,猪精子活力参数呈现先增加(1.0 mmol/L)后降低(3.0 mmol/L)的趋势;免疫印迹结果发现,低浓度钙离子(0.5 mmol/L)促进精子蛋白磷酸化,而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)显著抑制蛋白磷酸化;免疫荧光揭示,4.0 mmol/L钙离子处理组鞭毛处磷酸化蛋白明显少于未获能组和获能组;c AMP-PKA信号通路调节因子c AMP和IBMX以及钙调蛋白抑制剂W7和CZ均能有效缓解高浓度钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的抑制作用。结果提示,钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化起双重调节作用:即低浓度钙离子(0.5 mmol/L)有助于提高猪精子活力及蛋白磷酸化,高浓度钙离子(4.0 mmol/L)抑制精子活力和蛋白磷酸化;而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)可能通过c AMPPKA信号通路和Ca2+/Ca M通路抑制鞭毛处与精子活力有关的蛋白(动力蛋白或轴丝蛋白)磷酸化,进而抑制精子活力。     

获能前后绵羊精子的差异蛋白质组学分析

为了探索获能前后绵羊精子蛋白质的动态变化，通过串联质谱标签结合液质联用分析技术，对获能前后绵羊精子的总蛋白进行定量分析。结果显示：获能前后绵羊精子的差异表达蛋白共有203个，获能后表达上调蛋白质27个，表达下调蛋白质176个。差异表达参与解剖结构发育、生殖等生物学进程；从细胞组分看，差异表达蛋白定位在细胞溶质、质膜中；从分子功能看，主要参与氧化还原等过程。差异表达蛋白也参与蛋白酶体、Hedgehog和cAMP等信号通路。通过差异蛋白表达结合文献分析，筛选出乳铁蛋白。Western blot结果表明，乳铁蛋白在绵羊精子中存在，且在获能后表达量极显著降低(P<0.000 1);RT-qPCR结果表明，乳铁蛋白在获能前后绵羊精子中均存在，且差异极显著(P<0.001),说明乳铁蛋白对绵羊精子获能有一定的影响。     

17℃保存对猪精子亚组分蛋白酪氨酸磷酸化的影响及中药保护作用

实验旨在分析17℃保存对获能精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响,通过精子蛋白亚组分分离及酪氨酸磷酸化鉴定,研究精浆以及中药水提液对保存精子获能相关蛋白酪氨酸磷酸化的影响。选择获能指标-酪氨酸磷酸化分析新鲜猪精子和17℃保存猪精子,提取精子全蛋白、膜蛋白、核蛋白以及骨架蛋白,利用WB分离及鉴定酪氨酸磷酸化差异。结果显示:17℃保存条件下,获能精子在40～45、46～50 ku分子量膜蛋白酪氨酸磷酸化程度减弱;未获能精子在30～35 ku分子量胞浆蛋白磷酸化程度增强,出现似"获能"现象;精浆在保存中起到提供营养的作用但易导致细菌滋生;中药水提液对精子保存过程中的保护效果体现在精子获能培养后,鞭毛中段、主段酪氨酸磷酸化和新鲜精子无明显差异。     

肝素和钙离子载体诱导猪射出精子体外获能的研究

本文采用肝素和钙离子载体诱导猪射出精子体外获能,根据对去透明带仓鼠卵的穿透情况评价获能效果,并用台盼兰·姬姆萨染色观察精子的死活及顶体状态。结果表明,未经获能处理的猪精子不能穿透仓鼠卵,肝素和I-A均能诱导猪精子体外获能并引起顶体反应。经获能处理的精子,在授精后2小时穿透卵子,4小时开始形成雄原核,6小时形成发育良好的雄原核。肝素处理以100μg效果最好,穿透率达77.8%,有原核卵百分率达47.2%;I-A处理以0.3uM为宜,穿透率达66.7%,有原核卵百分率达42.4%。咖啡因与肝素和I-A具有协同作用,能提高精子的穿透能力。有顶体反应的活精子百分率与穿透率呈强正相关(肝素组:r=0.97,P<0.01;I-A组:r=0.94,P<0.01)。     

精子功能相关精浆蛋白质的蛋白组学研究进展

精浆蛋白质对生殖过程中的精子功能有显著影响,包括顶体反应、精子获能、精子贮存、精子竞争和受精。精浆蛋白质的研究已有很长的历史,而且牛精浆蛋白、热休克蛋白、富含半胱氨酸分泌蛋白等几种主要的精浆蛋白质已被成功分离鉴定。蛋白质组学研究方法和技术的迅速发展,为全面解析精浆蛋白质组提供了新的研究策略,提高了研究者探索精浆蛋白质未知领域的效率。作者综述了精子功能相关精浆蛋白质研究的相关信息及近年来精浆蛋白质组的研究进展,从蛋白质水平上阐述了精浆蛋白质与精子获能、贮存及受精等功能的关系。     

抑制泛素结合酶改变猪卵母细胞透明带泛素化状态及精-卵结合能力

本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加泛素结合酶(E2)抑制剂对卵母细胞透明带蛋白泛素化水平及精-卵结合能力的影响。试验分为6组:对照组、DMSO组、5、10、15和20μmol·L^-1 NSC697923处理组。采用Western blot方法分析体外成熟培养液中添加不同浓度泛素结合酶抑制剂NSC697923对猪卵母细胞透明带泛素化水平表达的影响。通过Hoechst染色检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:1)猪卵母细胞体外成熟培养液中,添加10、15和20μmol·L^-1 NSC697923显著降低卵母细胞成熟率(P<0.05),透明带硬化时间(P<0.05)以及精卵结合率(P<0.05)。2)对照组和各处理组的透明带蛋白在61、81、106 ku处发生不同程度的泛素化标记,而添加15和20μmol·L^-1 NSC697923显著地降低透明带蛋白泛素化水平(P<0.05)。综上表明,猪卵母细胞体外成熟过程中泛素结合酶(E2)改变成熟卵母细胞透明带泛素化水平以及精卵结合能力。     

透明质酸对猪精子活率,获能,顶体反应及体外受精穿透率的影响

采用具有高繁殖力的种公猪的新鲜精液及冷冻精液，加入不同获能剂咖啡因及透明质酸，在３９．５℃、５％ＣＯ２培养箱中孵化培养。结果表明，透明质酸能够在体外条件下保持精子的活率，并维持在稳定的水平，鲜精为４２．６％～４７．８％，冻精为２０．４％～２５．６％。荧光剂Ｈｏｅｃｈｓｔ染色表明，透明质酸能够显著增加培养３６０ｍｉｎ后的活精子率。在无蛋白来源的ｍＢＯ培养液中，培养０～６０ｍｉｎ，精子发生自发的获能和顶体反应，而受获能剂影响，精子发生获能的时间带在各处理组之间显著不同：咖啡因处理组的获能时间带是６０～３６０ｍｉｎ，透明质酸处理组则是６０～１８０ｍｉｎ。体外受精试验表明，去除卵母细胞周围卵丘细胞时，透明质酸和咖啡因对精子穿透率的影响没有区别；而在卵丘细胞存在的前提下，咖啡因处理组的穿透率显著高于透明质酸处理组。     

获能液和DMSO对猪精子获能效率的影响

为了探讨获能液和二甲基亚砜(DMSO)对猪精子获能效率的影响,试验采用SPSS 14.0软件进行分析,各处理平均值采用邓肯氏多重比较。结果表明:CM获能液获能3小时时超激活运动率为57.9%;mTBM获能液获能4小时时超激活运动率为55.7%;0.1%DMSO获能液获能30分钟时精子活率为70.20%,顶体反应率为70.44%,与其他组相比差异显著(P<0.05)。     

精子顶体酶抑制剂及其泛素化的研究进展

精子顶体酶抑制剂抑制精子顶体酶活性以便阻止精子遭受损伤,而成功受精的必要条件是有活性的顶体酶释放,此过程需泛素-蛋白酶体途径降解顶体酶抑制剂,从而顶体酶抑制作用被解除。本文主要针对精子顶体酶抑制剂、蛋白泛素化以及顶体酶抑制剂泛素化的研究进展作一综述。