鹅细小病毒VP1与VP3非重叠序列的克隆与原核表达

根据鹅细小病毒GPVH1株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对其结构蛋白VP1与VP3非重叠核苷酸序列进行PCR扩增，并克隆到表达性载体pGEX-6p-1，经酶切鉴定筛选出阳性克隆，并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plysS进行原核表达，并用SDS—PAGE鉴定，结果表明融合蛋白在表达性细菌BL21中重获得了高效表达。     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考CerBank发表的GPV B株全基因序列，设计并合成一对引物，通过PCR技术扩增出GPV H1株NS2基因，目的片段长约1．4kb，将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析，结果表明：GPV H1株NS2基因全长1356bP，编码451个氨基酸，与国外已发表的GPV B株相比核苷酸序列同源性为98．75％，推导氨基酸序列同源性为98．67％。     

鹅细小病毒不同毒株VP3基因的序列分析比较

分别将GPV4个分离株通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，并与PMD18-T质粒载体连接，转化到感受态大肠秆菌TG1中，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明：VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP3基因同源性较高(95．64％—99．81％)。但强弱毒株间也存在一定差异。     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

蓝狐细小病毒VP2基因与NS1基因的克隆与序列分析

根据GenBank上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,分别设计扩增VP2基因与NS1基因的特异性引物,采用PCR技术扩增蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BF-PV)泰安分离株(BFPV-TA)的VP2基因和NS1基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析.结果显示,BFPV-TA VP2基因含有1个ORF,全长1 755 bp,共编码584个氨基酸,第219位氨基酸发生I→V(219I→V)改变,300G→P,411E→A;BFPV→TA NS1基因含有1个ORF,全长2 007 bp,共编码668个氨基酸,8个氨基酸残基发生改变,43R→H,135H→Y,172K→R,179A→E,350D→N,4091→V,574I→V,616D→V.BFPV-TA VP2基因与CPV和FPV参照株的同源性在98.4%～99.4%,BFPV-TA NS1基因与CPV和FPV参照株的同源性为98.6%～99.1%.VP2基因系统发生分析,BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切,但NS1基因系统发生分析,BFPV-TA成单独的分支.     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

参照GenBank发表的GPVB株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出GPVS1株NS2基因,目的片段长约1.4kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明:GPVS1株NS2基因全长1356bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的GPVB株相比核苷酸序列同源性为98.89%,推导氨基酸序列同源性为98.89%。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

小鹅瘟病毒VP3基因的原核表达

根据GenBank已发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计并合成1对特异性引物,经PCR扩增得到了1 457 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-VP3.经0.1 mmol/L IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到表达.Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的反应原性.为开发相应的基因工程疫苗奠定了理论基础.     

鹅细小病毒QY分离株NS2基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增广东清远分离株(QY株)NS2基因的一对引物,利用PCR技术扩增出来长约1.5kb的目的片断,将其克隆到PMD18-T载体上,筛选重组质粒并进行了序列测定及分析,测序结果表明,GPV分离株NS2基因由1356个核苷酸组成,编码451个氨基酸。经与B株、DN株、FS株进行同源性比较,核苷酸的同源性分别为99.1%、99%和99%;推导的氨基酸同源性分别为98.7%、98.7%和987%。     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白VP3基因遗传变异及其原核表达

根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPV GD-01株的VP3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM(R)-T后测序,分析了GPV GD-01株VP3基因的遗传变异情况,并进行原核表达.结果表明,GPV GD-01株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV VP3基因具有较高的遗传稳定性.结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV VP3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础.原核表达显示,VP3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性VP3表达蛋白.SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的VP3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础.     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。