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探究薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离的最适条件,为薰衣草品种优化和育种工作提供基础数据和理论依据。以薰衣草幼嫩叶片为原材料,采用化学诱导方法诱导薰衣草脱分化形成愈伤组织,利用酶解法促使原生质体游离;结合染色排除法计算原生质体活力。实验结果表明,当MS培养基中加入2,4-D(1.8mg/L)和6-BA(0.5mg/L)时,薰衣草的出愈率最高,可达88%;愈伤组织在纤维素酶和果胶酶的含量分别为1.8%、0.5%的条件下,酶解原生质体的产量最高,可达1.180×10~5个/g,原生质体活力最高,可达78.05%。本实验获得的高效愈伤组织诱导条件,为后续愈伤组织再生体系研究提供资料支持。建立了原生质体分离体系,稳定的获得了高产量、高活力的原生质体。 相似文献
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以转双抗虫基因741杨无菌苗叶片为材料,对叶片原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了分析研究.结果表明,上部叶片产量和活力均高于其他叶位,在实验的浓度范围之内,Macerozyme R-10(离析酶)、Cellulase Onozuka R-10(纤维素酶)、Driselase (Sigma)(崩溃酶)对原生质体的产量和活力无显著影响.适宜转双抗虫基因741杨叶片原生质体游离与纯化的条件为无菌苗上部叶片为材料,0.7 mol/L甘露醇的CPW盐溶液预质壁分离1~1.5 h CPW+0.5% Macerozyme R-10+0.25% CellulaseOnozuka R-10+0.025% Driselase (Sigma)+ 0.5 mol/L甘露醇(pH 5.7),酶解温度27℃,酶解时间10 h,用“过滤-离心-漂浮法”纯化原生质体. 相似文献
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杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。 相似文献
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用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析,对不同材料原生质体得率进行比较,对提取的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养,对原生质体形成的愈伤组织以MS和改良B5培养基附加不同浓度NAA、6-BA、2,4-D、PEG、KT、ZT等进行分化培养.试验结果表明纤维素酶对原生质体提取得率有极显著影响,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为纤维素酶O.5%、果胶酶0.3%、甘露醇0.6 mol·L-1、酶解8 h;不同材料原生质体提取得率有显著差异;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中形成新的愈伤组织,其它方式培养的不同材料原生质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解体;用30余组配方进行了五叶地锦胚乳愈伤组织原生质体形成的新愈伤组织的分化培养,继代6~10次后仍无分化迹象. 相似文献
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用正交设计法优化枣树ISSR-PCR反应体系 总被引:5,自引:0,他引:5
采用正交设计的方法对枣ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用DPS数据处理软件分析。实验结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Mg2+影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立枣ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U、Mg2+1.0 mmol/L模板DNA 1.0μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。 相似文献
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以洒金柏种子为材料,研究了NaCl胁迫下赤霉素和不同浓度的钙组合对其萌发效果的影响。结果表明,2.5 mg/L GA3+25 mmol/L Ca2+处理下的发芽率、发芽指数比对照分别提高了19%、51%,差异显著;经2.5 mg/LGA3+20 mmol/L Ca2+处理的种子活力指数比单独使用20 mmol/L的Ca2+提高了48.02%;而2.5 mg/L GA3+15mmol/L Ca2+处理的发芽势比对照提高了18.7%。同时盐胁迫下,洒金柏幼苗内可溶性糖及可溶性蛋白含量均增加,其中2.5 mg/L GA3+10 mmol/L CaCl2处理下的可溶性糖和2.5 mg/L GA3+15 mmol/L CaCl2处理下的可溶性蛋白含量增加幅度最为显著,分别比对照增加56.8%、120%。结果表明,GA3和Ca2+组合使用可缓解盐胁迫对洒金柏种子萌发的抑制作用。 相似文献
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白花柽柳的组培与快繁技术 总被引:2,自引:0,他引:2
以白花柽柳的茎段为外植体,进行组织培养和快速繁殖研究。结果表明:以MS培养基添加1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 2,4-D诱导愈伤组织的效果最好,出愈率达98.4%;以MS培养基添加1.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L IBA诱导愈伤组织产生芽的效果最好,出芽率达45.0%。以MS培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA直接诱导产生丛生芽的效果最好,出芽率达98.68%。以1/4 MS培养基诱导生根的效果最好,生根率达93%;以V沙子∶V草炭∶V珍珠岩=1∶1∶1的混合基质有利于试管苗的移栽,成活率达80%。 相似文献
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枣树原生质体分离条件的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
何业华 《中南林业科技大学学报(自然科学版)》1999,(1)
枣树原生质体分离研究是其原生质体培养与融合、外源遗传物质转化等研究的基础工作.用胚性悬浮培养细胞、细粒状胚性愈伤组织、未细切愈伤组织和已细切愈伤组织等4种材料进行原生质体分离.结果表明,枣树胚性悬浮培养细胞是最佳起始材料,用浓度为10g/L纤维素酶+1g/L离析酶+CPW盐(1320mg/LCaCl2·2H2O和100mg/LKH2PO4·H2O组成的混合液)+0.7mol/L甘露醇组成的混合酶液对起始材料进行16h的酶解,可获得较高的原生质体产量,且原生质体活力较高. 相似文献
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以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得到108·mL-1的原生质体;在PEG介导下,通过含有潮霉素浓度为300μg·mL-1的PDA选择培养基筛选转化子,每微克DNA获得41个转化子的平均转化效率。对转化子进行PCR鉴定表明:hph基因和GFP基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中,通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清晰的绿色荧光,且转化子的潮霉素抗性和GFP表达性状可以稳定遗传。 相似文献
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