鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK双抗原DNA疫苗的免疫保护效果观察

将构建的含鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)CDPK和3-1E双抗原的真核重组质粒proEC,在14日龄和21日龄分别免疫AA肉鸡,28日龄感染5×104个E.tenella孢子化卵囊,观察其免疫保护效果.结果显示,攻虫后1周,与proC组相比,proEC组能显著增强淋巴细胞转化和血清抗体水平(P＜0.05);与proE组和proC组相比,proEC组卵囊产量最低但差异不显著(P＞0.05),其相对增重低于proE组和proC组.结果表明,proEC双抗原DNA疫苗对E.tenella攻虫表现出一定双抗原协同保护效应.     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2.经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致.将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫3-1E基因工程活载体疫苗对肉鸡的保护效果

选1日龄健康的艾维音肉鸡120羽,随机分为非感染非免疫对照组(CK1组)、感染非免疫对照组(CK2组)、芽孢杆菌空载体对照组(Bacillus subtilis[pBE2],记为BS-P组)和基因工程菌试验组(Bacillus subtilis[pBE2-31E],记为BS-31E组)。试验组每千克饲料添加108 CFU重组枯草芽孢杆菌。17日龄时,各组鸡(CK1组除外)口服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽,感染后8d测定抗球虫指数,并每个重复随机抽取5只体质量相近的肉鸡测其生理生化指标。结果显示,试验组活载体疫苗对感染柔嫩艾美耳球虫的肉鸡有显著生理保护效果,抗球虫指数(ACI)B.S-31E组显著低于CK1,比CK2组显著提高了18.8%(P<0.05)。同时,与CK2组相比,试验组肉鸡血清一氧化氮合成酶(iNOS)活力和一氧化氮(NO)含量显著提高(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、过氧化氢酶(CAT)活力显著上升(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.01);乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)含量显著升高(P<0.05),尿酸(UA)、血清葡萄糖含量显著降低(P<0.01或P<0.05)。结果表明,表达3-1E抗原基因的重组枯草芽孢杆菌作为活载体疫苗对肉鸡抵抗柔嫩艾美耳球虫感染具有一定的保护效果。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定

根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至p MD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2%~99.8%,氨基酸的同源性均在98.2%~100%。然后将重组质粒和表达载体p GEX-4T-1分别用Xho I和EcoR I酶切后构建重组表达载体p GEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5 h的蛋白表达量可达到30%以上。     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

柔嫩艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为了确定柔嫩艾美耳球虫（Eimenatenella）早熟株合适的免疫剂量,本文设立7个早熟株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个／羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以8×10^4个／羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以存活率、增重、肠道病变记分、血便数量、卵囊减少率为观测指标。对免疫保护效果较好的3个免疫剂量进行重复试验,同时设置商品化球虫疫苗对照组,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验。结果显示：攻虫后,不免疫攻虫组出现5％死亡,而各免疫组来出现死亡;各免疫组卵囊减少率在61．57％～69．52％;200～2000免疫组的增重与不免疫不攻虫组差异不具备显著统计学意义（P〉0．05）;600～2000免疫组的肠道病变记分和血便数量均明显少于不免疫攻虫组（P〈0．05）。用600、800和1000进行重复试验,三个免疫组攻虫期间均来出现死亡,而不免疫组和疫苗对照组均出现5％死亡;三个免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组和疫苗对照组（P〈0．05）;早熟株免疫组的肠道病变记分和血便数量明显低于不免疫攻虫组（P〈0．05）,而疫苗对照组与不免疫攻虫组的相当（P〉0．05）;卵囊减少率在66.30％-78．75％,高于疫苗对照组的51．82％。结果表明,该柔嫩艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中600、800和1000个／羽的免疫效果均优于疫苗对照组,可考虑以600个／羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究

将 E.tenella BJ株的保护性抗原基因 TA4插入真核表达载体中 ,然后在其上游融合方式插入 Et1A基因 ,构建成核酸疫苗并进行体外表达。IFAT检测表明 ,p CT转染细胞的荧光亮度高 ,p CTE载体大 ,转染效率低 ,荧光较弱。动物保护性试验中 ,间隔一周两次免疫鸡后攻虫发现 ,核酸疫苗对球虫感染具有明显的保护作用 ,可显著减轻球虫感染引起的机体增重下降 ,其中 ,重组干扰素联合 p CT中剂量 (5 0 μg)免疫时 ,鸡的增重效果最为明显 ,盲肠病变值也最小 ,ACI可达 16 7.2。试验还发现 ,5 0 μgp CTE可达到 10 0 μg p CT的抗球虫效果 ,ACI在 16 0以上 ,说明融合插入两种基因构建的核酸疫苗对球虫感染的保护效果更佳     

鸡柔嫩艾美耳球虫生殖细胞特异性蛋白的免疫保护效果评价

为探讨鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)生殖细胞特异性蛋白(HAP2)对球虫感染的免疫保护作用,将HAP2重组蛋白(rEtHAP2)加弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂免疫雏鸡后,用E.tenella孢子化卵囊感染雏鸡,以雏鸡增重效果、卵囊排出量、肠道病变记分、血清抗体水平、淋巴细胞转化水平,评估rEtHAP...     

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的体液免疫机理研究

为了揭示鸡柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）病的免疫机制,试验从分子水平、细胞、亚细胞对人工攻毒病鸡特异性抗体、免疫细胞的动态变化及在抗球虫中的作用进行了探讨,试验结果如下：一是雏鸡感染E．tenella后,第6天即可在外周血液中检测出特异性IgG,于第18天达到峰值,第23天开始下降,第30天时降至感染后第7天的水平;二是揭示了雏鸡感染E．tenella后,鸡体IgG生成细胞的动态变化规律为：主要免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体和盲肠局部的IgG生成细胞于第2天和第3天开始增殖,在第9天至第16天达到峰值,然后逐渐下降,盲肠扁桃体中的IgG生成细胞在第18天降至对照组水平,盲肠、脾脏和法氏囊中的IgG生成细胞数在第22天仍高于对照组,且差异显著。     

五种不同地理株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性比较

用五个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella），即：广州株、保定株、长春株、北京株、沈阳株，对12日龄雏鸡分别进行免疫攻虫。通过OPG计数，粪便计分，盲肠病变计分，增重测定，计算保护率。结果发现不同地理株球虫的免疫保护率有明显差异，广州株80．2％〉保定株73．2％〉长春株68．4％〉北京株63．8％〉沈阳株51．0％。其中广州株比其他虫株有显著保护率（P〈0．01）。免疫后的雏鸡抽血进行CD4^＋、CD8^＋T细胞检测，结果各株均能引起两种T细胞数量增加，表明CD4^＋、CD8^＋T细胞在球虫免疫中起着重要作用。     

柔嫩艾美耳球虫rhomboid抗原基因在卡介苗中的克隆与表达

以含柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因的重组质粒为模板,应用PCR方法扩增该基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中.分别用限制性内切酶Pst I/Cla I和Pvu II/Cla I进行双酶切,将rhomboid目的基因克隆到大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pRho-261和pRho-361.将重组质粒电穿孔转化卡介苗,经热诱导后对其表达产物进行SDS-PAGE和western blot分析.结果表明成功构建了两个重组质粒,其表达产物与柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有免疫反应性,为重组卡介苗在鸡球虫病防治方面的研究奠定了基础.     

鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验

给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella)和/或堆形艾美耳球虫(E.acervulina)孢子化卵囊,出雏后在无球虫环境中笼养,1~10日龄每天收集各组粪便样本,计数克粪便卵囊数(OPG),并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、饲料转化率(FCR)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果显示,以E.tenella或E.acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚,其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致,有相似的排卵囊曲线,提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31.9%~51.7%提高到了76.5%~83.6%,RCR由攻虫对照组的4.11~4.89改善为2.72~2.96,ROP降至4.7%~23.5%。结果表明以一定剂量E.tenella和E.acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫E.tenella和E.acervulina卵囊组与单一接种E.tenella或E.acervulina卵囊组的免疫效果发现,混合免疫组的各项指标均稍优于后者。     

堆型艾美耳球虫pcDNA3-3-1E重组表达质粒的免疫保护性

将堆型艾美耳球虫保定株裂殖子3-1E基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组表达质粒pcDNA-3-1E,用碱裂解法大量提取重组表达质粒,纯化后免疫接种1周龄雏鸡。分别设高（100μg）、中（50μg）、低（25μg）3个剂量组,同时设活卵囊接种组、非免疫感染组和健康对照组。在7日龄时首免,14日龄加强免疫,1周后用2.5×105个E.acervulina保定株球虫孢子化卵囊进行攻毒试验。结果显示50μg的剂量可使试验鸡产生较强的抗球虫效果,攻虫鸡的卵囊产量下降67.67%,肠道病变记分降低66.96%,并使鸡的相对增重率达88.36%,ACI值为176.06。     

应用柔嫩艾美耳球虫苗预防鸡球虫病的试验

鸡球虫病是雏鸡肠道感染、由一种或多种球虫引起的急性流行性原虫病，是危害养鸡生产的主要疾病之一。长期以来，鸡球虫病的控制方法是采用药物防治，但在生产实践中，抗球虫药无一不遇到产生耐药性问题。近几年来．我市养鸡生产普遍采用连续应用多种抗球虫药的方法，解决了耐药性l司题，获得较好的保护效果。但是．药费开支较多，投药麻烦费工，尚有15％的发病率，0.49％的几亡率和生长受阻等生产损失。为提高养鸡生产的经济效益，在1995年10月至1996年底，我们采用球虫苗预防鸡球虫病，从试验观察到推广应用，均收到今人满意的效果，为防…     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

鸡柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4．0（C）-pEtK2-IL-2对其他球虫的交叉保护力

将柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4．0（c）-pEtK2-IL-2以50μg分别对14日龄和21日龄雏鸡进行胸部肌肉注射免疫，28日龄对各未免疫组与免疫组鸡分别口服接种柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫孢子化卵囊，36日龄剖杀，分析比较免疫保护效果。结果显示，柔嫩艾美球虫攻毒免疫试验组与柔嫩艾美球虫攻毒未免疫对照组比较，增重、盲肠病变记分、OPG值差异显著（P〈0．05），免疫保护效果明显，抗球虫指数（ACI）达186．50；而巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾关球虫攻毒免疫试验组的ACI分别为147．85、142．71和153．82，增重、盲肠病变记分、OPG值和ACI与相应的攻毒未免疫对照组比较，均有不同程度改善，免疫保护效果不明显。表明，该DNA疫苗对柔嫩艾美球虫的攻击具有完全免疫保护作用，而对巨型艾美球虫、堆形艾关球虫、毒害艾美球虫的攻击具有部分交叉保护力。