叶用莴苣热激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高温胁迫下的功能分析

【目的】通过克隆Hsp70相关基因,并利用VIGS分析叶用莴苣热胁迫下Hsp70表达量和形态变化,为解析热激蛋白基因Hsp70在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及RACE技术,获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在不同温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异,确定基因和高温的相关性。根据VIGS技术,构建p TRV-LsHsp702711瞬时沉默载体,转化农杆菌GV1301,注射法侵染叶用莴苣叶片,三周后经PCR鉴定得到阳性植株。对照组和阳性组在基因表达和形态上进行对比,对照植株和阳性植株热胁迫和干旱处理后再次分析LsHsp70-2711的表达特性,观测形态变化。【结果】LsHsp70-2711 cDNA全长为2 226 bp,开放阅读框为2 154 bp,编码718个氨基酸,与拟南芥(NP_187864.1)、番茄(NP_001266213.1)、水母雪莲花(AAB99745.1)等物种的Hsp70同源性达到80%以上,证明此基因属于Hsp70家族。根据qRT-PCR结果,高温胁迫下该基因在两个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平均高于热敏品种,耐热品种LsHsp70-2711的表达量最大值出现在42℃、60 min,37℃、60 min时热敏品种基因表达量达最大值,且在42℃高温下热敏品种‘P-S11’中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种‘G-S59’则能长时间保持较高的表达水平,此结果和田间两品种间耐热差异表现相符合。亚细胞定位显示,LsHsp70-2711主要在细胞质中。将构建好的载体侵入叶用莴苣,鉴定后获得阳性植株。由定量PCR结果可知,未进行胁迫处理的阳性植株与对照株相比,LsHsp70-2711表达量下降,茎长明显增长。热胁迫和干旱处理后的阳性植株LsHsp70-2711表达量显著低于对照植株,高温处理对LsHsp70-2711的影响大于干旱胁迫。【结论】LsHsp70-2711属于Hsp70基因家族,其与叶用莴苣耐热性相关。研究结果为解析叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711在叶用莴苣高温抽薹方面的功能提供了理论支持。     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因的克隆及表达分析

为了解叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因在高温下的作用机制,通过同源克隆及RACE技术克隆并获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因全长cDNA序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在不同叶用莴苣品种中的表达量差异。该基因全长2 400bp(KP258179),开放阅读框为2 106bp,编码701个氨基酸,与西瓜(AAC03416.1)、牵牛花(ABZ04081.1)、黄瓜(CAA52149.1)、菠菜(AAB91471.1)等HSP70蛋白高度同源。实时荧光定量PCR结果表明:高温处理时,该基因在热敏品种中表达没有明显增加,随着处理时间的增加甚至表现为下调,而在耐热品种中,其表达上调。成功克隆得到叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因,热胁迫下该基因在不同品种中的表达有一定的差异性,推测该基因可能与叶用莴苣耐热性相关。     

叶用莴苣LsHsp70-3701基因过表达载体的构建及遗传转化体系的优化

为研究叶用莴苣中Hsp70基因的功能,以提高其耐热性,构建LsHsp70-3701过表达载体,农杆菌介导法转化叶用莴苣。从叶用莴苣中克隆得到LsHsp70-3701,利用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切LsHsp70-3701和植物表达载体pCAMBIA1304,回收目的片段并连接,经鉴定后获得过表达载体。以‘P-S11'叶用莴苣为转化材料,针对遗传转化关键因素:苗龄、植物激素浓度、预培养时间、侵染液OD值、侵染时间和共培养时间进行优化。试验结果表明最佳转化条件为:苗龄5d的子叶,6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L,KT质量浓度为0.2mg/L,OD600为0.3,预培养2d,侵染10min,共培养2d。     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。     

灰飞虱2种热激蛋白基因Hsp70的克隆、分析

灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]是一种分布广,对环境有很强适应性的重要水稻害虫。热激蛋白70(Hsp70)家族是与生物体环境适应最为密切的一类蛋白质。本研究通过RT-PCR与RACE技术克隆灰飞虱Hsp70基因,利用生物信息方法分析了该热激蛋白的特征,采用实时荧光定量PCR技术研究该基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律。结果显示:克隆了Hsp70基因的2种c DNA全长序列,分别命名为Ls Hsc70(Gen Bank登录号为KF660252)和Ls Hsp70(Gen Bank登录号为KF660251)。Ls Hsc70全长为2 399 bp,编码657个氨基酸,编码的蛋白质等电点为5.3,分子量为73 000;Ls Hsp70全长为2 468 bp,编码690个氨基酸,编码的蛋白质等电点为5.8,分子量为74 900。Ls Hsc70和Ls Hsp70的氨基酸序列中均含有Hsp70蛋白质家族的3个签名序列及1个ATP-GTP结合位点。系统进化关系分析结果表明它们与多种昆虫的Hsp70氨基酸序列有较高的同源性。不同发育阶段的灰飞虱体内Ls Hsc70和Ls Hsp70呈现出不同的表达模式,Ls Hsc70在雄性成虫阶段表达量达到最大值,而Ls Hsp70的最高表达量在1龄若虫阶段。不同性别的灰飞虱成虫体内Ls Hsc70表达量有显著差异,而Ls Hsp70没有显著差异。高温和低温胁迫都可以诱导灰飞虱体内Ls Hsc70和Ls Hsp70的表达,在-4℃和-9℃的低温胁迫下,Ls Hsc70和Ls Hsp70分别达最大的表达量。在40℃,Ls Hsc70和Ls Hsp70表达水平均在处理后0.5 h时最高。而在-4℃,Ls Hsc70和Ls Hsp70的表达水平均在处理后1 h时达到最大值。结果表明灰飞虱可以通过调节体内的Ls Hsc70和Ls Hsp70表达,来应对不良的环境温度。     

基于转录组信息的叶用莴苣MADS-box转录因子家族分析

[目的]基于转录组数据鉴定分析叶用莴苣MADS-box基因家族,筛选高温促进叶用莴苣抽薹过程中MADS-box家族特异性表达的基因,以期为叶用莴苣高温诱导抽薹的分子机制鉴定提供理论依据.[方法]从叶用莴苣转录组数据中鉴定获得MADS-box家族转录因子并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR技术分析叶用莴苣易抽薹品种'S39'在高温处理下MADS-box基因的表达模式.[结果]在叶用莴苣转录组中共鉴定到14个MADS-box转录因子,其编码的蛋白质含有212～253个氨基酸,蛋白质大小为24026.50～29380.16 Da,理论等电点范围为5.27～9.44,其中2个为稳定蛋白,12个属于不稳定蛋白,均为亲水性蛋白.亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核.qRT-PCR结果表明,在高温处理下,LsMADS32表达量无显著规律;Ls-MADS16和LsMADS37表达总体呈下降趋势;LsMADS5,LsMADS14,LsMADS15,LsMADS29,LsMADS35,LsMADS39,LsMADS43,LsMADS45,LsMADS48,LsMADS54和LsMADS56表达趋势基本相同,呈先上升后下降趋势,LsMADS15在高温处理7d后达到峰值,其他基因在高温处理5d后达到峰值,其中LsMADS54在高温处理5d后骤升1000倍,LsMADS56在高温处理5d后骤升70倍.[结论]MADS-box家族中的部分成员可能与高温诱导抽薹密切相关,LsMADS54和LsMADS56是叶用莴苣响应高温诱导后抽薹开花调控网络中的潜在的重要转录因子.     

外源生长素对叶用莴苣抽薹及相关生理的影响

[目的]进一步补充加快叶用莴苣育种进展,实现周年生产.[方法]选取耐抽薹品种GB-25、中间型品种GB-26以及易抽薹品种GB-30分别喷施:0、10、40、100 mg/kg的外源IAA.在第0、9、18、27、36天测量农艺性状、分析不同品种叶用莴苣抽薹特性以及叶片中生理营养.[结果]结果表明耐抽薹品种GB-25第18天中、高浓度组开始抽薹,第27天低浓度组开始抽薹,第36天对照组开始抽薹;中间型品种GB-26第9天高浓度组开始抽薹,第18天中浓度组开始抽薹,第27天低浓度、对照组开始抽薹;易抽薹品种GB-30第18天全部试验组开始抽薹.外源IAA浓度越高,抽薹程度越显著,生理营养达到峰值的时间也越早;且不同品种叶用莴苣抽薹时间存在明显差异.[结论]叶用莴苣耐抽薹品种与中间型品种比易抽薹品种对外源IAA响应更强烈;外源喷施IAA可提前完成生理营养的累积过程.     

叶用莴苣LsARF3基因克隆及在抽薹中的作用

【目的】探明LsARF3基因在叶用莴苣抽薹中的作用。【方法】采用基因克隆的方法克隆LsARF3基因，运用生物信息学软件对cDNA序列进行分析，并用瞬时沉默技术分析LsARF3基因在叶用莴苣抽薹中的作用。【结果】LsARF3基因的全长CDS序列为1 794 bp;编码了597个氨基酸；该蛋白的分子量为65 653.86,理论等电点为7.78。LsARF3基因在茎尖中的表达量随着高温处理时间延长持续升高。【结论】LsARF3基因可能促进叶用莴苣抽薹。     

叶用莴苣LsARF1的生物信息学分析及其表达

[目的]为了探究LsARF1基因在叶用莴苣抽薹中的作用机制.[方法]采用ProtParam、SignalP4.0、SOPMA、NCBI CD-search、SWISS-MODEL、DNAMAN7.0、MEGA7等生物学软件对其进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR分析该基因在不同温度下随时间变化的表达情况.[结果]序列分析表明,该基因的开放阅读框为1968bp,编码656个氨基酸,并保留了ARF结构域.实时荧光定量PCR分析表明,在高温处理下,该基因在易抽薹品种GB-30中表达下调.[结论]LsARF1基因可能在生菜抽薹过程中发挥重要作用.     

不同品种半结球叶用莴苣抽薹特性分析

[目的]为了探明莴苣抽薹过程中的生理学基础,实现叶用莴苣的周年生产提供理论依据.[方法]采用高温33℃/25℃(日/夜)处理,研究5个品种的抽薹性,及抽薹过程中的农艺性状.[结果]根据茎尖花芽分化情况以及茎长快速伸长的时期,发现五种半结球叶用莴苣的耐抽薹性强弱依次是GB-25、GB-23、GB-26、GB-31、GB-30;半结球叶用莴苣的株高与抽薹性呈显著负相关关系.[结论]结果表明,GB-25、GB-23为耐抽薹品种,GB-31、GB-30为易抽薹品种,GB-26介于两者之间.耐抽薹性越强的品种株高增长得越迟缓.     

杜洛克猪70～115 kg体重阶段饲料转化效率的遗传参数估计

采用单性状混合模型和多性状混合模型估计了568头体重为70～115 kg的杜洛克猪的饲料转化效率的遗传力及其与生长性状的遗传相关。结果表明,料重比(feed conversation ratio,FCR)和剩余采食量(residual feed intake,RFI)的遗传力分别为0.38和0.20。饲料转化效率性状之间的遗传相关较高(0.90)。FCR与各生长性状间表型相关及遗传相关都高于RFI与生长性状间的相关,尤其是FCR与日增重之间的相关为-0.47。RFI与所有生长性状的表型相关都接近于0,与背膘厚(back fat,BF)呈一定的正遗传相关(0.15),与眼肌面积(loin eye area,LEA)和瘦肉量(lean meat content,LMC)呈较高的负相关(-0.37和-0.48),与日增重之间的相关则接近于0。综上,杜洛克猪70～115 kg体重饲料转化效率指标具有中高等遗传力,与生长性状有一定的遗传相关,尤其是FCR,因此使用该阶段测定数据计算FCR或RFI是合理可行的。     

Synthesis, Isolation, and Equilibration of 1,9- and 7,8-C70H2

Equilibration of 1,9- and 7,8-C(70)H(2) has allowed the relative free energy of these isomers to be measured. These "simplest hydrocarbon derivatives of C(70)" are formed by hydroboration of C(70) at room temperature. Analysis of the platinum-catalyzed equilibration of these isomers yielded a relative free energy at 295 kelvin of 1.4 +/- 0.2 kilocalories per mole, with the 1,9 isomer being more stable. This value is in excellent agreement with the ab initio HF/6-31 G(*) calculated energy difference of 1.3 kilocalories per mole, whereas semiempirical calculations gave poor agreement.     

荷斯坦牛HSP70-1基因遗传多态性与乳腺炎抗性关系分析

利用PCR-SSCP和PCR-RFLP相结合的方法检测HSP70-1基因在253头中国荷斯坦牛中的多态性,并分析其多态性与体细胞评分(SCS)的相关性.结果表明,HSP70-1基因扩增片断的1 623 bp处产生G-A的突变,1 623bp处产生G-A-C的突变.两位点都是沉默突变,未引起氨基酸序列的改变.HSP70-1基因分别经EcoRⅡ、BglⅠ、FokⅠ消化后表现多态性.经χ2 适合性检验,中国荷斯坦牛在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态.同时,群体基因座不同基因型与SCS相关分析的结果表明,2 409位点基因型与SCS相关性不显著,1623位点与SCS相关性显著,CC型SCS指标显著低于AG、GG型(P＜0.05),CC基因型可作为乳腺炎抗性的有利基因型,可将HSP70-1基因作为奶牛乳腺炎候选基因,将应用于分子标记辅助选择育种,为乳腺炎抗性牛群的选育奠定一定的理论基础.     

荷斯坦奶牛 HSP 70-1基因多态性与热应激的关联性

为我国南方荷斯坦奶牛抗热应激品种的选育提供理论依据,使用 PCR-SSCP 方法,对327头荷斯坦奶牛 HSP 70-1基因编码区进行单核苷酸多态性检测,并分析其与热应激的关联性。结果表明：HSP 70-1基因在1112位点发生 C→A 突变,有 CC、CA 和 AA 基因型,其中 CA 型个体血清三碘甲腺原氨酸（T3）显著低于其他基因型个体（P ＜0．05）,甲状腺素（T4）显著低于 AA 型个体（P ＜0．05）,直肠温度显著低于 CC 型个体（P ＜0．05）;在3390位点发生 T→C 突变,有 TT、TC 和 CC 基因型。1112位点的皮质醇（Cor）及3390位点各指标基因型间差异均不显著（P ＞0．05）。CA 型个体对抗热应激的能力更强,1112多态位点可以作为提高奶牛抗热应激能力的一个潜在遗传标记。     

新绿70

<正>选育单位山西省农业科学院蔬菜研究所品种来源98-08-5-1×98-07-15-13。母本98-08-5-1是1998年从北京引进的早熟大白菜F1中选优势单株经多代定向选择自交纯化选育而成的一个优良自交不亲和系,父本98-07-15-13是1998年从山东引进的中熟大白菜F1中筛选优良单株经多代自交纯化选育而成的一个自交不亲和系。     

棉花黄萎病拮抗细菌2-70(Bacillus subtilis)菌株定殖能力的研究

本试验通过灭菌土和非灭菌土两种土样,试验前分别对这两种土样进行三种不同的处理即：用拮抗菌芽孢液浸种、土壤全部混菌和部分混菌进行盆栽试验。本文主要通过盆栽实验,考察棉花黄萎病拮抗细菌2-70在土壤中的定植情况及在棉花根内和根际的定植情况。结果表明,在实验室条件下,拮抗细菌2-70能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达106cfu/g土左右,经过五个月后仍能保持较高的抑菌活性,并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。通过对棉苗根内细菌的回收,证实拮抗细菌2-70能在棉花根内定殖,数量达到103cfu/g。     

烟草Hsc70-2的克隆及对马铃薯Y病毒侵染烟草的促进作用

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。