洋葱AcSVP基因的克隆及其表达分析

为了研究SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)基因在洋葱花芽分化和发育中的作用,本研究以洋葱70-1为试材,克隆得到了1个SVP同源基因,命名为AcSVP,并采用荧光定量PCR对该基因的表达模式进行了分析,结果表明:AcSVP包含1个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸。氨基酸同源比对结果显示,AcSVP的氨基酸序列与水仙的相似性较高。系统进化结果也显示洋葱的AcSVP与水仙的亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,AcSVP在洋葱未开放的花蕾中表达量最高,在花薹抽出前的叶中次之,在花中的表达量最低。根据以上研究结果推测,AcSVP可能参与调控洋葱的花芽分化。     

洋葱AcSVP基因的克隆及其表达分析

为了研究SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)基因在洋葱花芽分化和发育中的作用,本研究以洋葱"70-1"为试材,克隆得到了1个SVP同源基因,命名为AcSVP,并采用荧光定量PCR对该基因的表达模式进行了分析,结果表明:AcSVP包含1个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸。氨基酸同源比对结果显示,AcSVP的氨基酸序列与水仙的相似性较高。系统进化结果也显示洋葱的AcSVP与水仙的亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,AcSVP在洋葱未开放的花蕾中表达量最高,在花薹抽出前的叶中次之,在花中的表达量最低。根据以上研究结果推测,AcSVP可能参与调控洋葱的花芽分化。     

棉花亲环素基因GhCYP2的克隆及实时定量表达分析

[目的]分离棉花中的亲环素基因.亲环素基因是一类多基因蛋白质家族,广泛存在于高等植物各个组织和器官中,参与多种重要的生理生化过程.[方法]以小麦亲环素wCyP3基因蛋白序列(AF262984)为探针序列,在GenBank中与棉花EST序列进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条长912 bp的cDNA序列.[结果]序列分析表明,该cDNA含有一个编码174个氨基酸的开放阅读框,基因的编码产物为亲环素蛋白,将该基因命名为GhCYP2(GenBank登录号:JN032296).采用Clustal X将ChCYP2的氨基酸序列与其他生物亲环素氨基酸序列进行相似性比对,发现与水稻、拟南芥等生物的相似性较高,达到80;以上.利用实时荧光定量PCR技术分析了GhCYP2在棉花各个组织器官中的表达模式,检测结果显示:GhCYP2在棉花叶及18DPA棉纤维中的表达量最高,在根、茎、花、3～15DPA、21～30DPA棉纤维中均有适量表达.[结论]推测GhCYP2可能在棉花纤维伸长至次生壁合成的重叠期发挥着信号传导作用.     

意大利蜜蜂amLDH基因的克隆与表达分析

乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解和葡萄糖异生途径中一种发挥重要作用的蛋白酶。本研究以意大利蜜蜂为研究对象,RT-PCR和生物信息学方法克隆并分析了意大利蜜蜂乳酸脱氢酶基因及其表达产物的分子特征和结构功能,并利用qRT-PCR技术对amLDH基因在意大利蜜蜂不同级型、不同发育阶段的表达模式进行了分析。序列特征结果表明,意大利蜜蜂amLDH基因包含一个1 008 bp的开放阅读框,编码335个氨基酸,该氨基酸序列与中华蜜蜂高度相似(96.4%),并存在13个磷酸化位点、2个乳酸脱氢酶功能域,是一种稳定的疏水性蛋白。qRT-PCR结果表明,amLDH基因在不同级型、不同发育时期的表达差异显著(P<0.05)。工蜂卵期3日龄、雄蜂卵期3日龄、蜂王幼虫期4日龄表达最高,蜂王和雄蜂预蛹期至红眼蛹期表达均高于工蜂。本研究结果推测,amLDH基因在意大利蜜蜂的生长发育以及糖酵解中发挥重要作用,该研究结果能够为进一步探讨amLDH在意大利蜜蜂生殖发育中的功能提供理论依据。     

小菜蛾储存蛋白基因的克隆与表达分析

克隆和分析了2个小菜蛾的储存蛋白基因——Px AJSP-1和Px BJHSP-2.其中,Px AJSP-1属于芳基贮存蛋白,而Px BJHSP-2属于富甲硫氨酸储存蛋白.进化树分析表明,它们在同一目昆虫中相对保守.利用实时荧光定量PCR分析其表达模式,发现Px AJSP-1和Px BJHSP-2在4龄幼虫和蛹期高表达,且在脂肪体中的表达量远高于其他组织.     

蓝莓角鲨烯环氧化酶基因的克隆与表达分析

角鲨烯环氧化酶(SQE)催化角鲨烯合成三萜类骨架β-香树酯前体2,3氧化鲨烯,是熊果酸合成途径中的重要限速酶。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQE基因,全长序列1 744 bp,序列分析结果表明,其含有1 620 bp开放阅读框,编码539个氨基酸;氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQE蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.6%,与猕猴桃相似性为89.7%;不同植物SQE蛋白序列分析发现,该类植物SQE含有3个保守结构域,均在VcSQE中存在;荧光定量试验表明,VcSQE基因在叶中表达量最高,根中表达量最低。     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。     

甘蔗B12D基因全长cDNA克隆与表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)茎全长cDNA文库进行大规模测序,获得了B12D基因的全长cDNA序列,命名为ScB12D(GenBank Accession number:KF714497)。生物信息学分析表明,该基因全长771 bp,编码87氨基酸(ORF,104~367 bp);该基因编码的蛋白无信号肽,为亲水性非分泌型蛋白;有1个B12D家族保守结构域,二级结构为无规则卷曲;基因定位于质膜,参与能量代谢。同时,甘蔗ScB12D基因在不同物种间具有一定的保守性,在近缘植物中具有高度的保守性,与单子叶禾本科植物玉米、粟米、高粱及水稻的同源性超过90%,与双子叶甘薯和山茶的同源性在70%左右。荧光定量PCR表达分析结果表明,甘蔗ScB12D基因在根、蔗芽、茎(包括蔗皮和蔗髓)、叶片和叶鞘等组织中组成型表达,其中在叶鞘和根中表达量较高;在生物胁迫黑穗病胁迫下,该基因的表达量在所有时间段均呈下调趋势;在非生物胁迫时,该基因的表达受NaCl胁迫后表达量最高,在ABA胁迫下表达量次之,推测该基因的表达可能与甘蔗响应生物和非生物胁迫的机制有关。     

药西瓜UDP-糖基转移酶基因的克隆与表达分析

为明确药西瓜UDP-糖基转移酶催化葫芦素形成葫芦素配糖体的表达规律,以药西瓜品种"WM9"叶片为供试材料,采用RT-PCR技术克隆药西瓜UDP-糖基转移酶基因,并对编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以ACTIN为内参基因,分析获得的2个药西瓜UDP-糖基转移酶基因在不同组织器官中的表达规律。结果表明:克隆得到2个UDP-糖基转移酶基因,分别为1 546 bp和1 559 bp的cDNA全长序列,命名为UDP-E1和UDP-E2。对扩增获得的序列进行生物学信息分析,确定UDP-E1基因的完整开放阅读框(ORF)为1 314 bp,可编码氨基酸437个,理论分子量为49.02 ku,等电点为5.99,属稳定蛋白,Genbank登录号MK576125。UDP-E2基因的ORF为846 bp,可编码氨基酸281个,理论分子量为32.78 ku,等电点为5.23,属不稳定蛋白,Genbank登录号MK576126。这2个基因属于糖基转移酶超家族。UDP-E1和UDP-E2均与香瓜、黄瓜的UDP-糖基转移酶基因序列相似性最高。在各组织器官中,UDP-糖基转移酶均有表达,且在茎中表达水平最低,叶中表达水平最高。     

陆地棉无短绒突变体GZnn的纤维发育及其基因表达分析

 【目的】利用棉花无短绒突变体GZnn为材料,分离与棉花纤维发育相关的重要基因,从而揭示棉花纤维发育的分子机理。【方法】通过扫描电镜观察GZnn与其近等基因系TM-1在纤维发育上的差别;采用差异显示RT-PCR方法寻找GZnn与TM-1之间的差异表达片段,并进行相应分析。【结果】用扫描电镜观察突变体GZnn与TM-1的胚珠表面纤维细胞起始发生的情况,发现GZnn不仅在纤维细胞发生和延伸上延迟,而且纤维细胞总数也明显减少。利用差异显示PCR进行比较筛选,获得了12个差异表达的EST片段,其中,DS3只特异性地在GZnn 开花前（-3～0 DPA）的胚珠中特异表达,而在其近等基因系TM-1中没有表达,推测DS3可能是一个纤维启动过程中的MYB类负调控转录因子。【结论】本研究利用棉花无短绒突变体GZnn发现,棉纤维细胞在早期分化和形态建成过程中大量基因表达,对其中的关键基因的表达模式和功能开展深入研究将有助于阐明棉纤维分化发育的分子机理,为棉花遗传改良提供理论基础。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

棉花2个新的PPR基因的克隆及表达模式分析

【目的】从棉花中克隆2个新的PPR基因,分析其序列结构、基因表达和亚细胞定位,为深入研究这2个基因在棉花中的功能提供依据。【方法】利用棉花EST库,通过RT-PCR从陆地棉徐州142中克隆得到2个PPR基因：GhPPRH1和GhPPRH2;应用生物信息学方法对2个基因编码蛋白序列进行预测分析,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析目的基因在不同组织及纤维不同发育时期的表达模式;利用棉花子叶瞬时表达系统对上述2个基因编码的蛋白进行亚细胞定位。【结果】GhPPRH1和GhPPRH2均属于PPR基因家族的PLS亚家族;GhPPRH1和GhPPRH2的开放读码框的长度分别为1 917和2 556 bp,编码638和851个氨基酸;GhPPRH1蛋白有18个PPR基序,包含1个E+结构域和1个DYW结构;GhPPRH2蛋白有17个PPR基序,包含1个E结构域,1个E+结构域和1个DYW结构;将GhPPRH1和GhPPRH2蛋白的氨基酸序列与GenBank数据库中的9条同源蛋白以及棉花中已经报道的5个PPR蛋白的氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示,GhPPRH1与水稻RF1b蛋白亲缘关系较近,推测其可能与胞质雄性不育的育性恢复相关,而GhPPRH2与玉米PPR5蛋白亲缘关系最近,推测可能会影响细胞器一些转录本的RNA编辑;半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的结果表明,GhPPRH1和GhPPRH2在根、茎、叶、花及纤维发育不同时期均有表达,GhPPRH1在根中表达较高,而GhPPRH2在根、叶及15 d的纤维中表达较高;亚细胞定位结果显示,GFP标记的GhPPRH1蛋白的绿色荧光与线粒体Marker的红色荧光重叠,表明该蛋白可能定位于线粒体,GFP标记的GhPPRH2蛋白的绿色荧光与叶绿体自发的红色荧光重叠,表明GhPPRH2可能定位在叶绿体。【结论】从棉花中获得2个新的PPR基因,均属于PLS亚家族成员,亚细胞定位显示可能在线粒体和叶绿体中,推测其功能可能与细胞器中RNA的加工、修饰等过程有关。     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...     

陆地棉Ghuhrf1基因及其启动子的克隆与功能分析

在分子育种过程中,优良基因和组织特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的重要因素之一。分析转录组数据库中差异基因表达谱发现,Ghuhrf1为开花当天胚珠优势表达基因,推测该基因可能参与或调控棉纤维的合成。根据其EST序列设计引物,通过RACE技术获得Ghuhrf1基因的全长cDNA序列。荧光定量PCR分析表明,Ghuhrf1在开花当天的胚珠中显著表达。通过同源序列分析获得Ghuhrf1的上游启动子Ghuhrf1 Pro。Ghuhrf1 Pro全长为1 417 bp,含有GC box、CAAT box、CAT box、CCGTCC box和ACGT motif等顺式作用元件和组织特异性调控元件。根据组织特异性调控元件的分布位置构建了4个不同程度的缺失体转化烟草和拟南芥进行分析。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子Pro和缺失体Pro1（-1 180～+226 bp）、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)都能特异地驱动Gus基因在转基因拟南芥的叶片边缘尖部和莲座叶基部等分化生长旺盛部位表达,说明与分生组织表达相关的CAT box元件和CCGTCC box元件在启动子种子特异表达中起到重要的作用。同时,通过启动子缺失分析也表明,Ghuhrf1基因可能不是直接参与棉纤维的合成,而是间接的参与棉纤维原始细胞分化起始的调控。该结果为棉花纤维品质基因Ghuhrf1的功能研究提供了参考,并为棉花分子育种工程提供了新的调控元件。