黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌YS-9412-130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明，该酶由256个氨基酸组成，分子量为33000Dar，等电点pI为9.45，米氏常数Km为5×10-3mmol/L；酶的最适作用pH范围为9.5～10.5，最适作用温度30℃，具有一定的抗氧化稳定性。Ca2+、Mn2对酶有激活作用，而Hg2+、Ag+对酶有抑制作用。DFP、NBS严重抑制酶的活性,而同时该酶也能被EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。     

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130高产菌株的选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130菌株为出发株,经亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线（UV）与微波（MI）复合诱变和自然选育,获得1株产低温碱性蛋白酶高产稳定的突变株YS－9412－130－SW1－104,其产低温碱性蛋白酶为出发株的16倍。在摇瓶发酵培养条件下,酶活力达2320U／ml(20℃测定）,该诱变株具有Ref^r、Str^r、Amp^r和Met^-、Lys^-标记。突变株与出发菌株在细胞形态上比较,结果表明二者没有显著差异。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌YS－9412－130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质，结果表明，羟基、咪唑基、ε－氨基及胍基均与酶活性有关，而羟基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶多克隆抗体的制备

利用纯化的黄海黄杆菌海洋低温碱性蛋白酶（Marine Low-temperature Alkaline Protease,MLAP),采用背皮内多点注射和皮下组织注射免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化。用ELISA的方法对其效价检测表明,其效价为128000。作者所做的Western印迹实验证明了抗原抗体的结合具有高度的特异性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术，每吨发酵液可得酶粉20kg，粗酶比活大于20×10     

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW1－104为出发菌,在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体,对原生质体进行复合诱变,对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化,最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌SW2－104,在自来水培养基中能够大量产酶,产酶活力为3910U／ml。从而解决了黄海黄杆菌YS－9412－130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备，对黄海黄杆菌YS－9412－130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发，通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌YS－9412－130生长与代谢的基本规律，证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度，确定其一系列数值，从而推导出细胞生长与产物合成的动力学数学模型。     

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW2－104为培养菌株,进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明,在以1％葡萄糖为碳源,以3.5％豆饼粉为氮源,无机盐：0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.1%Na2CO3、0.2?Cl2,起始pH值7.0,接种12h种龄的种子4％,20℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养36h,菌株产酶活性最高。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的应用研究Ⅱ.——洗涤剂用包覆型酶的配伍特性与应用效果评价

论述了洗涤剂中的低温碱性蛋白酶的物理和化学特性、去污性能及它与常规洗涤助剂的配伍性。实验结果表明，该包覆型酶最适反应温度为35℃，pH为10。在温度40℃以下、pH5-11范围内均具有良好的稳定性，同时对低温有突出的适应性和抗氧化稳定性；与常规洗涤剂各成分配伍性良好，且低温条件下能有效降解蛋白污渍，主要性能均优于国内外同类产品。     

海洋低温蛋白酶生产菌YS-9412-130原生质体的制备与再生

以海洋低温蛋白酶生产菌株YS-9412-130为研究对象，从传代、菌龄、溶菌酶浓度与酶解时间、甘氨酸与EDTA预处理以及稳定剂对该菌原生质体形成与再生的影响进行研究。结果表明，在相同条件下，第一代菌至第五代菌原生质体的形成率分别为86．9％、70．3％、66．8％、63．4％、60．2％，再生率分别为10．5％、18．6％、17．9％、18．2％、17．8％；取该菌对数生长前期、对数生长中后期、稳定期部分菌液制备原生质体，原生质体的形成率分别为72．1％、70．4％、60．5％，再生率为13．4％、18．9％、10．4％；溶菌酶浓度为2．5mg／mL、5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL，酶解60min，原生质体的形成率分别为40．6％、70．8％、81．8％、95．6％，原生质体的再生率为19．0％、19．2％、19．0％、10．6％；使用10mg／mL溶菌酶酶解YS-9412-130菌30min、60min、90min、120min，原生质体的形成率分别为30．8％、81．3％、81．7％、82．9％，原生质体的再生率分别为19．2％、19．3％、16．9％、11．2％；在细菌培养液中添加终质量浓度为5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL和40mg／mL的甘氨酸，培养该菌16h后制备原生质体，原生质体的形成率分别为81．0％、81．1％、90．3％、90．8％、90．6％，再生率为19．1％、19．0％、19．3％、12．0％、9．0％；EDTA对原生质体的形成稍有促进作用，但作用超过30min会影响原生质体的再生；分别以0．6mol／L Kcl、0．3mol／L KCl＋0．3mol／L蔗糖、0．6mol／L蔗糖作为稳定剂，原生质体的再生率分别为10．9％、19．6％、25．9％。结论认为，YS-9412-130原生质体制备的最佳条件为选用第2代YS-9412-130菌，在培养基中添加终质度浓度为10mg／mL的甘氨酸培养16h后，再将菌体置于含有0．05mol／LEDTA的高渗溶液中30℃预处理30min，用10mg／mL溶菌酶，30℃酶解60min，再用0．6mol／L蔗糖作为原生质体再生培养稳定剂，比较适合于YS-9412-130原生质体的制备与再生。这一试验结果将为通过原生质体技术对YS-9412-130菌进行遗传改良提供重要参数。     

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样,经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养,用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从1000多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株YS－9412－130。对其初步研究结果表明,该菌只能利用有机氮源生长;在接近自然海水盐度、温度20℃、pH在7.0-9.0条件下,菌体生长和产酶较好。