猪骨髓抗菌肽 PMAP-37 基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA，用RT-PCR 扩增抗菌肽PMAP-37 基因，获得1 条约282 bp 的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α 中。从筛选的阳性克隆中分离出PMAP-37 基因，测定其序列。分析表明，该片段为PMAP-37 cDNA 的部分序列，编码167 个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪骨髓抗菌肽PMAP-37 cDNA 部分序列同源性达到98%。以PMAP-37 基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR 法，以18S rRNA 为内标，研究不同体重猪骨髓抗菌肽PMAP-37 基因表达的差异。结果发现，从刚出生到20 kg，PMAP-37 基因表达呈上升趋势，在20～40 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势，40～60 kg，PMAP-37 基因表达又呈上升趋势，在60～90 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势。     

Cloning of Heart-type Fatty Acid-binding Protein (H-FABP ) Gene of Swine and Difference of Its Expression at Different Stages

从1, 30, 50, 70和90 kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP）基因，获得1条211 bp的片段，以pGEM-T 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli ) DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因，测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列，与已报道的猪肌肉组织中的H-FABP cDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18S rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明，从出生到50 kg，猪H-FABP基因表达呈下降趋势；50～90 kg阶段, H-FABP基因的表达又有所上升。     

猪肥胖基因片断的克隆及不同日龄猪肥胖基因表达的差异

从杜长嘉(Duroex Landracex Taihu)猪的皮下脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增肥胖基因(obesegene；ob)，获得1条504bp的片断，以pGEM-T Easy Vector为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Eschenchia coli)中。从筛选到的阳性克隆中分离出肥胖基因，测定其序列，分析表明该片段为肥胖基因cDNA的部分序列，编码167个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的主体部分。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中ob cDNA部分序列同源性达到99．41％。氨基酸序列同源性达到98．94％。以ob基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin为内标，研究不同日龄的猪脂肪组织ob基因表达的差异，1-28日龄ob基因表达呈上升趋势，28日龄达到最高，随后，到56日龄ob基因表达又呈下降趋势。     

猪心型脂肪酸结合蛋白基因的克隆及不同生长阶段表达的差异

从1,30,50,70和90kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA,用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因,获得1条211bp的片段,以pGEM-T为载体,将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因,测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列,与已报道的猪肌肉组织中的H-FABPcDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础,构建了优化的半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明,从出生到50kg,猪H-FABP基因表达呈下降趋势;50～90kg阶段,H-FABP基因的表达又有所上升。     

猪SOCS3基因克隆及其在不同生长阶段表达差异研究

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增SOCS3基因，获得1条约332 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出SOCS3基因，测定其序列，分析表明，该片段为 SOCS3 cDNA的部分序列，与GenBank中登录的猪SOCS3 cDNA部分核苷酸序列同源性达到100%。以SOCS3基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18s rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肠系膜脂肪中SOCS3基因表达的差异。结果发现，从初生到90 kg，SOCS3基因在肠系膜脂肪中表达量呈逐渐增加的趋势，其中90 kg较初生时增加了141％（p<0.05）。     

番茄乙烯信号转导相关基因EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

摘要：根据拟南芥?穴Arabidopsis thaliana ?雪、烟草?穴Nicotiana tabacum ?雪EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT-PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum )果实中得到一个486 bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆,命名为Le-EIL。该克隆含有一个1 845 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79%，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59%、56%、52%、46%。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le-EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强, 在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60 d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

广西巴马小型猪肥胖基因（leptin）成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99．06％,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84．5％以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为元义突变。     

番茄乙烯信号转导相关基因剧EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

根据拟南芥（Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT—PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum)果实中得到一个486bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆，命名为Le-EIL。该克隆含有一个1845bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79％，与拟南芥EIN3,EIL2和EIL3的同源性分别为59％、56％、52％、46％。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le—EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强，在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

本研究根据其它植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以拒盐型盐生植物小花碱茅根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序,在GenBank中注册;序列分析结果表明：该片段长约600bp,编码198个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其它植物Actin基因序列同源性均在84％以上,与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达94％以上。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

猕猴桃ACC合成酶基因家族四个成员的克隆

通过PCR方法从中华猕猴桃中分离出ACC合成酶基因家族的四个成员（AC－ACS1A、AC－ACS1B、AC－ACS2和AC－ACS3）的基因组DNA片段，AC－ACS1A、AC－ACS1B和AC－ACS2与其它植物该基因的氨基酸序列同源性最高可达76％以上，而AC－ACS3与其它植物ACC合成酶基因的氨基酸序列同源性均低于60％，与已知的其它猕猴桃ACC合成酶基因的同源性在51％－56％之间，且不存在MSSFGL保守区，因而属于一个未见报道的新成员。