昆虫对Bt杀虫蛋白的抗性机制及治理策略

转Bt基因抗虫作物在害虫综合防治中发挥重要作用，是新一代植物保护产品，其抗虫性能和经济效益已得到普遍肯定。然而由于转基因抗虫植物在整个生育阶段高水平的表达Bt杀虫蛋白，有可能会导致害虫对Bt杀虫蛋白产生抗性，抗性的产生将严重影响Bt植物的应用。田间已经发现小菜蛾Plutella xylostella（Linnaeus）对Bt杀虫剂产生了抗性，实验室人工汰选条件下已经有多种害虫对Bt杀虫蛋白产生了抗性，并对抗性产生的机制进行了研究，目前主要认为害虫产生抗性与杀虫蛋白与中肠细胞上受体蛋白结合能力的改变以及Bt杀虫蛋白在中肠的水解作用的变化有关，但抗性产生的机制还与其它因素有关，估计是多方面因素造成的，因此，抗性机制的产生还不十分清楚。目前已经制订了“高剂量＋庇护所”和多基因策略等一系列有效抗性治理策略，这些策略还需要在深入研究并阐明抗性机制的基础上，进一步完善，以实现Bt抗虫植物在害虫防治中的可持续利用。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),属于蜡样芽胞杆菌族,芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌,与其它芽胞杆菌的区别是在形成芽胞的同时,伴随有杀虫晶体蛋白(Cry蛋白)的产生。Cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫作用,因此,Cry蛋白以微生物杀虫剂或转Bt基因植物的形式而被广泛应用于害虫生物防治中。本文从Bt菌株的发掘、cry基因的转录调控机制、Cry蛋白的结构功能及作用机制等方面进行综述,为Bt杀虫蛋白的推广应用、Bt蛋白的定向改造和构建高效广谱的工程菌提供参考。     

基于比较基因组学分析苏云金芽胞杆菌防治蛴螬的相关功能基因

为挖掘对地下害虫蛴螬高效的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）菌株在杀虫及环境适应方面的关键功能基因,本研究对蛴螬高效的菌株261-1、Fcd114、1126-1、HBF-18和78-2以及对鳞翅目害虫高效菌株WBt-2、G03进行了基因组测序,并与对鳞翅目害虫高效菌株HD1、HD12、HD73和对蛴螬高毒力菌株Bt185等基因组进行了比较分析,重点分析比较了杀虫基因、多糖代谢相关基因、与其他微生物竞争和适应性相关的酰基高丝氨酸内酯水解酶（N-Acylhomoserine lactones hydrolase,aiiA）、突破和克服靶标昆虫免疫系统的免疫抑制因子A（Immune Inhibitor A,InhA）、具有抗病并能增效杀虫的双效菌素（Zwittermicin A,ZwA）等五大类基因和基因簇。研究发现,这些菌株按照其所含有的杀虫基因特异性可分为3个类型：对鳞翅目害虫有效的菌株（类型1）、对鞘翅目害虫有效的菌株（类型2）以及同时含有两种害虫有效基因的菌株（类型3）。对地下害虫蛴螬特异（类型2）的Bt菌株除了在杀虫基因上具有特异性之外,所含有的aiiA、InhA基因也有显著特点。相关研究为进一步对地下害虫蛴螬高效Bt菌株的改良提供了新思路。     

苏云金杆菌新菌株对金龟子幼虫的毒力比较

金龟子类幼虫是一类重要的地下害虫,可危害农、林、果、菜、草等多种植物。由于这类害虫危害植物地下部分或地面附近根茎部分,具有一定的隐蔽性,而且分布广,也是难以防治的世界性害虫。随着人们对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,以下简称Bt)资源调查与研究的深入,新的具有特异杀虫谱的Bt菌株陆续被发现。1992年,Ohba等在世界上首次从土壤中分离筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的Bt新菌株BuiBui。笔者于     

害虫对转Bt基因植物抗性的治理策略

转Bt基因植物在害虫综合防治中发挥着重要作用。但是害虫对转Bt基因植物可以产生抗性，从而影响其对害虫的防治效果和应用价值。通过制订合理的抗性治理策略可以使害虫对转Bt基因植物的抗性得到延缓和克服，在论述了转Bt基因抗虫植物的研究和应用现状的基础上，从IPM理论和生态学角度，就害虫对转Bt基因植物的抗性治理中的多毒素策略，高表达/低表达策略、避难区策略、特异性/诱导性表达策略以及其他可并用的防治手段进行了评价。     

苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展

马铃薯甲虫是重要的入侵害虫,严重威胁着我国粮食作物马铃薯的生产。苏云金芽胞杆菌是重要的农业害虫生防细菌,对马铃薯甲虫有良好的防治效果。本文围绕苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展与应用进行综述。主要从马铃薯甲虫的入侵与防治手段、苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白结构与杀虫机制、对马铃薯甲虫有活性的Bt毒蛋白研究进展、Bt毒蛋白对马铃薯甲虫的作用机制以及马铃薯甲虫对Bt毒蛋白的抗性机制等方面进行了综述。最后,从Bt新基因的挖掘和杀虫机理方面对苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进行了展望。     

对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展

半翅目害虫寄主范围广、危害时间长, 给我国农林业生产带来了严重的经济损失。应用有效的绿色防控手段替代化学杀虫剂防治半翅目害虫, 对于保障粮食安全生产、保护动物及人类生命健康、维护生态平衡具有重要意义。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis产生的杀虫蛋白对多种害虫展现出高效特异的杀虫活性, 对非靶标生物安全, 为全球农业、林业和卫生害虫的绿色防控做出了突出贡献。本文综述了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、危害特点及主要防治手段, 重点归纳了Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性研究进展以及挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白基础, 并针对Bt杀虫蛋白在半翅目害虫绿色防控方面的应用提出了建议。     

对植物寄生线虫具有活性的苏云金芽胞杆菌研究进展

植物寄生线虫是重要的植物病原物之一,给农业生产带来了巨大的经济损失。长期以来,一直缺乏有效防治植物寄生线虫的手段。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是重要的昆虫病原细菌,广泛应用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目害虫等农林及卫生害虫的防治;部分Bt菌株对植物寄生线虫具有很高的活性。本文总结了杀植物寄生线虫Bt菌株筛选的模型与方法的建立、Bt菌株杀植物寄生线虫的作用机理及其相关应用、以及杀植物寄生线虫的伴胞晶体蛋白与相关基因等,可望为杀植物寄生线虫Bt制剂的研究与开发提供借鉴。     

基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法

cry2基因对多种鳞翅目害虫具有高毒力,且与cry1A类基因无交互抗性,具有重要的应用价值。为了提高苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)cry2杀虫基因资源的筛选和鉴定效率,本研究分析了所有已报到的cry2A基因的保守区,设计了4对通用引物,对2000株Bt菌株基因组DNA混合样品进行了PCR扩增,并利用454高通量测序仪对这些混合扩增产物进行了测序。测序总量有280704条Reads,序列分析结果表明,这些Bt菌株中含有已知的所有9类cry2类基因,其中包括cry2Ae和cry2Ai这2类在国内Bt菌株中未见报道的基因;同时,发现了新型cry2类基因的片段;随后设计特异性引物,扩增获得了半长基因片段cry2-1和cry2-2,进一步利用重叠PCR法获得了全长新基因cry2X,该基因的编码区为1902 bp,编码633个氨基酸;其氨基酸序列与Cry2Ab13蛋白的相似性最高,为93%,属于第三等级的模式基因。建立聚合酶链式反应-高通量测序(polymerase chain reaction-high throughput sequencing,PCR-HTS)联用的基因鉴定方法,具有快速、灵敏、准确、高通量、覆盖范围广等优点,不仅可以对Bt菌株中已知杀虫基因进行鉴定,而且能够发现新的基因,将在Bt基因鉴定、发掘中发挥重要的作用。     

几种常用化学杀虫剂对Bt菌株生长影响的初步研究

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）可产生多种杀虫活性物质,是一种应用最广泛的微生物杀虫剂。最近研究表明Bt对化学杀虫剂抗性害虫有较好的防治效果,并且与化学杀虫剂的联合使用可以提高杀虫效果,减少化学杀虫剂的用量。为了进一步设计更好的Bt与化学杀虫剂协同控害方案,本论文研究了不同亚种的Bt菌株与常用化学杀虫剂的兼容性。泛基因组分析表明不同亚种的Bt菌株在基因组成上有较大差异,说明Bt菌株对化学杀虫剂的反应可能会有所不同。进一步化学杀虫剂对Bt增殖影响分析结果显示,溴虫腈对大部分Bt测试菌株有抑制,说明Bt与化学杀虫剂协同使用时需要测定两者兼容性。高效氯氰菊酯对所有常用的防治鳞翅目害虫的Bt杀虫剂亚种类型库斯塔克亚种（Bt kurstaki,Btk）和鲇泽亚种（Bt aizawai,Bta）菌株影响都不大,可以进行协同使用;氯虫苯甲酰胺和茚虫威对Btk菌株HD1有一定抑制作用,定虫隆对其有较好的促进作用,说明HD1与定虫隆协同使用效果更好;茚虫威对Bta菌株G03影响较小,定虫隆对其有一定的抑制作用,氯虫苯甲酰胺对G03则有一定的促进作用,说明G03及其衍生菌株可以与氯虫苯甲酰胺、茚虫威协同使用。本研究结果说明Bt菌株对不同杀虫剂的敏感性是有差异的,可以通过筛选获得兼容性好的组合,为进一步制定Bt杀虫剂与化学杀虫剂配伍方案与协同使用技术提供了理论指导与数据参考,对实现化学农药减量施用具有重要的指导意义。     

转Bt基因玉米对棉铃虫的抗性评价

棉铃虫Helicoverpa armigem（Htlbner）是常年危害玉米的重要害虫。转Bt基因抗虫玉米为害虫的防治提供了新的途径。采用室内离体生物测定方法测定了孟山都转Bt基因抗虫玉米Yield—Gard不同组织对棉铃虫初孵幼虫的杀虫活性以及田间人工接虫抗性鉴定。Bt玉米花丝、苞叶和幼嫩雌穗对棉铃虫具有较高的杀虫活性，取食Bt玉米花丝和幼嫩雌穗（籽粒和穗轴）的棉铃虫初孵幼虫不能存活和完成幼虫期发育，而对照分别有51．0％和22．0％个体完成幼虫期发育。以Bt玉米雌穗苞叶饲养棉铃虫初孵幼虫，5天后幼虫全部死亡，而非Bt玉米对照仅为16．0％，差异显著。田间花丝期人工接种棉铃虫抗性鉴定试验结果表明，Bt玉米雌穗被害率为3．5％，危害级别为0．007，百株存活幼虫14．3头。而非Bt玉米雌穗被害率达到82．5％，危害级别为2．51，平均百株存活幼虫79．6头，显著高于Bt玉米。这些结果说明转Bt基因玉米穗期对棉铃虫的防治效果明理．     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

如何正确使用生物农药-Bt

Bt是一种无公害纯生物农药 ,和化学农药相比 ,它的最大优点是广谱、高效、不伤害人、畜、家禽及害虫天敌 ,能有效地防治多种害虫。Bt农药的杀虫原理是药剂进入虫体后产生有毒的伴孢晶体 ,扰乱害虫正常的生理代谢 ,使害虫发病而死亡。它与化学农药的杀虫原理迥然不同 ,在使用技术上要求很严格 ,使用不当会降低药效甚至完全无效。据近几年的试验与实践 ,提高Bt农药防效的技术要点有以下几点 :1　防治对象经济作物类 :棉铃虫、红铃虫、造桥虫、烟青虫。蔬菜类 :菜青虫、小菜蛾、菜螟。粮食作物类 :二化螟、三化螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟、玉米…     

转Bt基因抗虫作物对非靶标生物的影响

迄今为止,已经获得了大量的抗虫转Bt基因作物。尽管这些作物中表达的Bt蛋白只是针对靶标害虫起到杀虫效果,但是抗虫转Bt基因作物是否会对非靶标生物产生影响一直存在争议。本文就抗虫转Bt基因作物对节肢动物群落、非靶标植食性昆虫、天敌和有益昆虫的影响进行了综述。综合评价认为,现有的抗虫转Bt基因作物对非靶标生物是安全的。     

转双价基因抗虫棉对主要害虫的抗性观察与防治技术要点

在比较研究转双价基因(Bt+CpTI)和转单价基因(Bt)抗虫棉对主要害虫的控制作用及其对非靶标害虫种群动态影响的基础上,研究提出了转双价基因抗虫棉主要害虫的综合防治技术。     

苏云金芽孢杆菌及其δ-内毒素基因的分类与鉴定

苏云金芽孢杆菌作为重要的杀虫微生物在生物防治中发挥了巨大作用。其分类鉴定对于研究资源的多样性、快速筛选优良菌株、预测其杀虫活性、分离克隆新的Btδ-内毒素基因等方面具有重要意义。本文对Bt菌株的分类、δ-内毒素基因分类、鉴定方法进行了分析讨论。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基区鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、crygAb和一种新的cry1类基因，SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达，在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）基因，并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段（1．95kb）插入表达载体pET-21b，转化Escherichia coli Rosetta（DE3）菌株，表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，LC60分别为100．74μg／mL和29．87μg/mL，进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

转Bt基因作物对植物—害虫—天敌食物链的影响

种植转Bt基因作物已经成为当前及未来农业的发展趋势。转Bt基因作物可以有效控制棉铃虫（〖WTBX〗Helicoverpa armigera〖WTBZ〗）、玉米螟（〖WTBX〗Ostrinia furnacalis〖WTBZ〗）等多种靶标害虫。但研究表明Bt作物的种植会改变害虫演化地位,并且Bt毒素可能沿着食物链传递,而对天敌构成潜在的威胁。基于Bt作物对植物—害虫—天敌食物链上各个营养级的影响研究,本文重点分析了Bt毒素对天敌种群结构及生物学的影响。     

运用电激转化技术构建杀虫工程菌

将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素杀虫蛋白基因(简称Bt基因)导入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),创建新型微生物农药,在国外已有产品试销。在国内,也已引起广泛重视。本实验室曾运用转座子接合转移技术,将Bt基因导入对小麦全蚀病防治效果显著、并有促进植物生长作用的荧光假单胞菌P303菌株中,构建了兼有杀虫防病作用的工程菌。此后,又运用电激转化技术将带有Bt基因的重组质粒转入P303菌株中,获得了具有杀虫活性的PT410、PT415等工程菌株。