高温中性蛋白酶基因的克隆、表达及验证研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶基因进行了克隆、测序及表达研究.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得特异性片段.经测序分析,其具有一个942 bp的蛋白酶完整阅读框.通过表达载体构建,获得质粒pPL-tnp,并转化至蛋白酶缺失受体菌枯草芽孢杆菌AB97013,经表达验证其蛋白酶最适作用温度和pH与出发菌相符.证明研究获得了高温中性蛋白酶基因及表达质粒pPL-tnp,并正确表达.     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。     

phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。     

Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达与性质测定

碱性蛋白酶作为广泛应用的蛋白酶之一,具有重要的工业应用价值。发掘优质的碱性蛋白酶基因,实现其高效表达,有助于更好的满足工业应用需求。分别将Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶基因pa1及pa2与表达载体pPIC9连接,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对于纯化后的重组蛋白PA1及PA2的酶学性质进行测定,二者最适pH均为8.5,最适温度均为60 ℃,与同类酶相比具有一定的优势;PA1及PA2的温度稳定性较好,50 ℃下酶活保持稳定,60 ℃下处理10 min,二者均保持70%左右的酶活;PA1及PA2的pH耐受范围宽泛,在pH 4.0~11.0的环境中处理1 h,均能保持80%以上的活性。此外,PA1及PA2对于表面活性剂和还原剂也表现出一定的耐受性。这些性质都表明PA1及PA2是具有工业应用潜力的优质碱性蛋白酶。     

Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达与性质测定

碱性蛋白酶作为广泛应用的蛋白酶之一,具有重要的工业应用价值。发掘优质的碱性蛋白酶基因,实现其高效表达,有助于更好的满足工业应用需求。分别将Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶基因pa1及pa2与表达载体pPIC9连接,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对于纯化后的重组蛋白PA1及PA2的酶学性质进行测定,二者最适pH均为8.5,最适温度均为60 ℃,与同类酶相比具有一定的优势;PA1及PA2的温度稳定性较好,50 ℃下酶活保持稳定,60 ℃下处理10 min,二者均保持70%左右的酶活;PA1及PA2的pH耐受范围宽泛,在pH 4.0~11.0的环境中处理1 h,均能保持80%以上的活性。此外,PA1及PA2对于表面活性剂和还原剂也表现出一定的耐受性。这些性质都表明PA1及PA2是具有工业应用潜力的优质碱性蛋白酶。     

解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

为了获得高效的中性蛋白酶基因,试验用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌中扩增中性蛋白酶基因(npr),通过Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,将该基因与表达载体PET-28a连接,同时转入到大肠杆菌BL21中表达,通过SDS-PAGE电泳技术对构建的工程菌的基因表达产物进行分析。获得特异npr基因序列含1 566 bp,编码522个氨基酸,含有完整的ORF,同源性达到100%。蛋白酶的分子量为57.4 k Da。IPTG能诱导中性蛋白酶基因在重组菌进行表达,通过改变IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等因素,得出在添加剂IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1,30℃诱导4 h为最佳诱导条件,获得最高酶活为450 U·m L-1。     

一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶rPrA经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了rPrA对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况.结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分子量约为44 ku,在pH3.0的发酵条件下酶活最高,可达46.92U/mL.该酸性蛋白酶的最适pH值为3.0,最适温度为35℃.Mn2+对该酶活性有激活作用,多种金属离子对该酶有抑制作用;0.1 mmol/L的Pepstain A即可完全抑制酶活,说明此重组酶的活性中心有天冬氨酸残基.对大豆蛋白和酪蛋白的初步水解试验可知,当E/S为4 000 U/g时,此重组酶对大豆分离蛋白和酪蛋白的水解度分别为9.0％和8.34％.优化发酵条件以及与多种蛋白酶进行复配,该重组蛋白酶将在蛋白水解中有很好的应用前景,有望应用到畜禽饲料加工行业.     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

米曲霉碱性蛋白酶基因的前导区对其在毕赤酵母中表达的必要性

为探讨前导区对米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中表达的必要性,本试验首先将米曲霉碱性蛋白酶的成熟肽编码基因(alp-m)和表达载体pPIC9K双酶切后连接,得到重组表达载体pPIC9K/alp-m.然后将其线性化后电转化毕赤酵母GS115.筛选阳性转化子进行甲醇诱导表达,并进行SDS-PAGE分析和碱性蛋白酶活力测定,同时在转录水平上对目的基因进行了Northern blot检测.将得到的结果与以前研究中得到的带有前导区的米曲霉碱性蛋白酶成熟肽基因在毕赤酵母中的表达结果进行对比.结果表明:如果没有前导区,米曲霉碱性蛋白酶成熟肽基因在毕赤酵母中表达,无论在胞内和胞外均检测不到目的蛋白.由此可见,米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中表达时必须有前导区的参与.     

特异腐质霉来源漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6～11的范围内酶的相对活力均在70%以上。     

耐有机溶剂脂肪酶基因lipI的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

为了实现耐有机溶剂脂肪酶基因的真核表达,参照GenBank公布的脂肪酶基因序列设计简并引物,通过PCR扩增出G.geotrichum SXL-107的全长1 692 bp、编码563个氨基酸的脂肪酶基因lipI,基因登录号为JX074060.利用Signal P 3.0软件对lipI基因序列进行分析,将去除自身信号肽的成熟lipI基因克隆到诱导型表达载体pPIC9K上,构建胞外重组表达载体pPIC9K-lipI,转化毕赤酵母KM71,发酵培养72 h,发酵上清液中脂肪酶活力达到70 U/mL,与野生型脂肪酶产生菌Galactomyces geotrichum SXL-107相比,脂肪酶活力提高7倍.获得的重组脂肪酶的最适温度40℃、pH值为6.5,在10％的甲醇溶液中作用48 h后仍然保持60％以上的酶活力.     

岭南黄鸡肌生长抑制素基因成熟肽的克隆及酵母表达质粒的构建

根据Genebank上登录的鸡的myostatin基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物,并分别在两引物前设计两个酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ,克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定后,构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m,经测序鉴定,结果表明所克隆的myosta-tin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡（AF019621）、猪（AY208121）和家鹅（AF440862）的MSTN-m核酸序列同源性分别可达到99%、92%、86%,但翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100%、99.1%及99.1%。     

三角褐指藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因克隆及其表达分析

γ-亚麻酸在人类的健康与营养中具有重要的功能,利用基因工程手段提高其产量是满足其需求日益增大的途径之一。Δ6脂肪酸脱饱和酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶,催化亚油酸（C18∶2 Δ9,12）到γ-亚麻酸（C18∶2 Δ6,9,12）的反应。通过克隆三角褐指藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因,并连入酵母表达载体pPIC3.5K中,在毕赤酵母中进行了表达,结果表明：重组酵母经甲醇诱导后表达转入的外源基因,气-质联用分析显示重组毕赤酵母中含有γ-亚麻酸和SDA（18∶4 Δ6,9,12,15）,其含量分别为2.5%和0.8%。     

土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。