猪卵母细胞体外成熟研究

[目的]探讨猪卵母细胞体外成熟的最佳培养条件。[方法]以NCSU-23为基础培养基,研究不同激素组合和培养时间（36、40、44和48 h）对猪卵母细胞体外成熟的影响。[结果]猪卵母细胞体外培养44 h后,成熟率最高,为81.4%;猪卵母细胞在成熟培养液培养22h后,再在无激素培养液中继续培养22 h时,成熟率最高;添加性腺激素的组成熟率显著高于不添加组,差异显著（P〈0.05）。[结论]在体外成熟培养过程中,添加性腺激素能显著提高猪卵母细胞成熟率。     

猪卵母细胞极体排出的规律

试验把猪卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,观察它们在不同时间排出的极体数,以研究体外卵母细胞排出极体的规律.结果表明,A级和B级的COCs培养48 h的极体排出率最高(83.2％和65.7％),明显高于同级水平培养24...     

猪体细胞克隆技术的研究进展

核移植（Nuclear Transplantation,NT）是将动物早期胚胎或体细胞的核移植到去核的受精卵或成熟卵母细胞的细胞质中,从而获得重构胚,并使其恢复细胞分裂,继续发育为与供体细胞基因型完全相同的后代的技术。     

猪卵母细胞体外成熟与冷冻保存的初步研究

比较从不同卵巢卵泡直径获得的卵母细胞体外成熟能力的差异 ,并研究其冷冻保存效果。结果表明 :在体外成熟培养液中添加 10 % (体积分数 ,下同 )ECS的成熟率 (72 86 % )显著高于添加 10 %NCS (6 2 2 1% ) (P <0 0 5 ) ,而添加10 %pFF则抑制卵母细胞的体外成熟。随着卵泡直径的增大 ,卵母细胞体外成熟能力逐渐增强。采用程序冷冻保存方法 ,培养成熟组的卵母细胞成活率 (35 5 9% )显著高于培养前 (2 4 6 4 % )和培养 2 4h组 (2 3 36 % ) (P <0 0 5 )。培养 2 4h(77 2 2 % )和培养成熟 (72 81% )组 ,卵母细胞解冻后的形态完整率均显著高于培养前 (5 3 2 4 % ) (P <0 0 5 )。     

利用渗透压研究猪卵母细胞发育过程中核迁移规律

本研究采用高渗操作液(氯化钠)处理体外成熟卵母细胞。结果表明,发现培养42 h的卵母细胞,中期核与第一极体刚开始分离。培养44 h的卵母细胞,中期核与第一极体已经分离,达到15°。培养46 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达45°。培养48 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达到近90°,中期核开始向卵母细胞中迁移。经过高渗处理的卵母细胞经过后续操作后可以得到克隆个体。结果表明,利用体外成熟培养42~44 h的卵母细胞进行去核操作,可以达到近100%的去核效率,而不会影响胚胎的正常发育。     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的，胞质不均匀和不含卵丘细胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３差异极显。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显。Ｅ，ＣＦ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ２能显地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液（加入２×１０＾－＾６     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

猪体细胞克隆研究进展

综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

猪体细胞克隆胚的胚胎移植研究

试验采用Spindle-view法对卵母细胞进行去核以构建重构胚,并利用这些重构胚先后对12头上海白猪进行了胚胎移植。结果有1头猪顺利怀孕到终期,经剖腹产产下1头健康的克隆巴马小型猪,另外,有3头母猪移植后51 d、76 d和77 d返情,怀孕率33.3%。     

猪体细胞胞质注射核移植研究

首例体细胞克隆动物“多利”羊诞生以来,各种体细胞核移植动物相继成功克隆,但其克隆效率很低（低于10％）以及大都表现出不同程度的器官衰竭或发育畸形等。猪体细胞核移植在异种器官移植和克隆性治疗上具有重大意义,但其克隆效率更低（1%-2％）。利用胞质注射技术对比不同供核细胞、是否经血清饥饿和不同时间段激活对重构胚发育的影响,在其重构胚卵裂率上,试验结果表明：颗粒细胞与胎儿成纤维细胞无显著差异（43．37％,45．98％;P〉0．05）;血清饥饿与否无显著差异（45．61％。50．71％;P〉0．05）;在核移植后1-3h和3-5h激活显著高于立即激活（51．82％,56．98％。8．51％;P〈0．05）。     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

试验旨在研究不同电融合参数(场强、脉冲时程)对猪核移植胚融合率及发育能力的影响。采用44～48h成熟培养的去核猪卵母细胞作为受体细胞,颗粒细胞为供体。结果表明,在20μs脉冲时程条件下,0.8kV·cm-1组融合率显著高于0.4、1.2、1.6kV·cm-1组(P0.05)。0.8、1.2kV·cm-1组卵裂率显著高于0.4、1.6kV·cm-1组(P0.05)。场强为0.8kV·cm-1条件下,20μs组融合率显著高于30、40、50μs组(P0.05)。卵裂率20、30μs组显著高于40、50μs组。根据试验数据,本试验室最佳融合电参数为:0.8kV·cm-1、20μs,1次脉冲。     

小鼠体细胞核移植研究进展

哺乳动物体细胞核移植的研究是当今生命科学研究的热点之一。小鼠由于其繁殖周期短、材料来源比较容易,成为重要的模式动物。对小鼠体细胞核移植的国内外研究现状进行了综述,为进一步研究其他哺乳动物核移植提供了理论依据。     

哺乳动物体细胞核移植后核重编程的研究进展

介绍了核移植后核重编程的机制,并讨论了核移植重编程中DNA甲基化和组蛋白乙酰化对核移植胚胎的影响。     

猪体细胞核移植技术及研究现状

自2000年Polejaeva I A获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,分析了猪核移植中的技术难点和影响因素。     

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

【目的】本研究系统比较了体外受精胚（IVFEs）、孤雌激活胚（PAEs）以及体细胞核移植胚（NTEs）的发育率和囊胚质量，同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。【方法】利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs，开展体外培养。【结果】（1）IVFEs、 PAEs 和NTEs的卵裂率分别为72.0％，66.0％和63.5％，各组间没有显著差异(P>0.05)；囊胚形成率分别为11.0％，22.6％和16.9％，也不存在明显不同(P>0.05)；然而，在囊胚质量，即ICM细胞数/总细胞数的比例上， IVFEs和NTEs均优于PAEs（0.448％，0.356％ vs 0.122％，P<0.05）。（2）对PAEs来讲，以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组（35.4％ vs. 22.6％，P<0.05）；而对NTEs而言， 两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当（26.6％ vs. 21.1％，P>0.05），虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组（47.5％ vs. 63.5％，P<0.05）。【结论】（1）PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差；（2）对PAEs理想的培养基，当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。     

广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

通过建立广西巴马小型猪体细胞核移植培养体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供最佳条件.试验探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率.结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75％;广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89％and 6.74％vs.82.95％and 5.68％,P＞0.05);腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40％、67.53％和6.49％.采用盲吸法可以对体外成熟猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚.     

体细胞核移植技术生产转基因猪胚胎的研究

以转染绿色荧光蛋白基因的猪胎儿成纤维阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,体外成熟卵母细胞为核移植受体构建绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,研究供核细胞的处理、注核部位及重构胚融合/激活时间对转GFP克隆胚早期发育的影响.结果显示,胎儿成纤维细胞血清饥饿与非饥饿培养10 d处理组,采用卵周间隙核移植重构胚的卵裂率（82.35%和79.07%）差异不显著(P >0.05);体外培养42~44 h 卵母细胞进行胞质内和卵周间隙注核的重构胚胎,其卵裂率（81.11%和76.80%）差异不显著（P >0.05）;将卵周间隙注射法构建重构胚在0~1 h,2~4 h 和6~8 h 进行融合/激活操作,前2组重构胚卵裂率（75.61%和83.07%）无显著差异(P >0.05),但显著高于第3组（60.00%）的卵裂率(P <0.05).     

体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。     

H3K4和H3K9三甲基化在猪体外成熟卵母细胞和克隆胚胎中的表达分析

该研究主要运用单细胞免疫荧光技术分析猪卵母细胞和克隆胚胎发育过程中,H3K4和H3K9三甲基化(H3K4me3,H3K9me3)的表达情况.收集体外成熟0h,6h,12h,24h,30h,36h,42h的猪卵母细胞;同时通过体细胞核移植操作获得一细胞、四细胞、桑葚胚和囊胚期克隆胚胎,经过免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察H3K4me3和H3K9me3修饰在卵母细胞和胚胎中的变化情况.免疫荧光结果显示,在不同减数分裂阶段的猪卵母细胞内均能观察到H3K4me3的表达,并且呈现出逐渐下降的趋势;在生发泡期(GV),生发泡晚期(L-GV)和生发泡破裂(GVBD)阶段的卵母细胞中能发现明显的H3K9me3表达,随着减数分裂的进行,H3K9me3表达消失,在第一次减数分裂中期前阶段(Pre-MI)到第二次减数分裂中期(MⅡ)阶段卵母细胞中未发现H3K9me3荧光信号.H3K4me3和H3K9me3在不同发育阶段的猪克隆胚胎中都有表达,其中H3K4me3在不同阶段胚胎中荧光信号强度相近,H3K9me3在四细胞胚胎中荧光强度降低,在桑葚胚和囊胚中荧光强度出现升高的趋势.以上结果说明,H3K4me3参与调控猪卵母细胞体外成熟的整个过程,H3K4me3和H3K9me3在猪体细胞核移植胚胎早期发育过程中可能具有调控作用.