Antibody Testing Against Canine Coronavirus by Immunoperoxidase Plaque Staining

The application of the immunoperoxidase (IP) plaque staining procedure (IP test) to the diagnosis of canine coronavirus (CCV) infection was investigated. The IP test did not react with sera from either 15 specific pathogen-free (SPF) dogs or 7 SPF dogs immunized with a multivalent vaccine, including canine parvovirus type 2, canine distemper virus, canine adenovirus type 2, and canine parainfluenza virus. To compare the IP test with the neutralizing test (NT), sera from 240 healthy dogs and from 3 experimentally CCV-infected dogs were examined. All 60 sera positive for NT antibody were positive for IP antibody, and all 180 sera negative for NT antibody were negative for IP antibody in the healthy dogs. The IP titres showed similar changes with time after CCV inoculation to those of the NT titres in the experimentally infected dogs. These findings indicate that the IP test specifically detected anti-CCV antibodies. When the IP test and NT were compared in dogs with diarrhoeic signs. 2.1% of 48 sera and 20.3% of 74 sera, which were all negative for NT antibody, were positive for IP antibody in the dogs of under one year of age and at least one year of age, respectively. The difference between the IP and NT titres (log₁₀ [reciprocal of IP titre] – log₁₀ [reciprocal of NT titre]) for the diarrhoeic dogs of under one year of age (2.350±0.931) was significantly larger than that for the healthy dogs (0.982±0.447) (p<0.0001), the NT titre being negative or very low, despite a high IP titre in many diarrhoeic dogs. Hence, the IP test is more able to detect anti-CCV antibodies, especially in dogs showing clinical signs. The IP-positivity rate was significantly higher in the diarrhoeic dogs of under one year of age (48.7%) than in the healthy dogs (25.0%) (² = 19.844, p<0.0001), suggesting that CCV may contribute to diarrhoea in many juvenile dogs.     

犬瘟热的诊断

犬瘟热是危害犬、狐、貂最严重的烈性传染病之一。作者对某试验动物犬饲养厂的病死犬进行临床症状观察,病理剖检及实验室诊断,通过病毒的分离培养及间接免疫荧光鉴定,确诊为犬瘟热病毒感染。鉴于该病的危害程度,建议加强对犬瘟热病的诊断及监控。     

貂犬瘟热病的诊断

貂犬瘟热是危害貂、狐、貉最严重的烈性传染病之一。作者对某貂养殖场的病死貂进行临床症状观察,病理剖检及实验室诊断,通过病毒的分离培养及鉴定,确诊病死貂为貂犬瘟热病毒感染。鉴于养殖场中该病的存在及对养貂业的危害,建议加强对貂犬瘟热病的诊断及监控。     

犬瘟热病毒的检测技术

从免疫学和分子生物学两方面对犬瘟热病毒检测技术进行了综述 ,并探讨了今后的研究方向。     

貉群暴发犬瘟热的诊断

为了对2006年7~9月间山东、河北的多个地区貉群发病情况进行诊断,根据临床症状,剖检变化,实验室诊断,确诊为犬瘟热病。     

抗犬瘟热病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗犬瘟热病毒(CDV)血凝素蛋白的单克隆抗体,以CDV弱毒株Onderstepoort免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合制备杂交瘤细胞。用昆虫杆状病毒表达系统表达的血凝素蛋白作为ELISA包被抗原,进行杂交瘤细胞筛选,获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名3A8、3E4和1C7。经鉴定,抗体均为IgG1亚型,轻链为kappa链。杂交瘤细胞培养上清中抗体效价为1∶64~1∶256,腹水中抗体效价为1∶10~5~1∶10~7,病毒中和试验表明,3E4对CDV具有中和活性,腹水中抗体中和效价为1∶512。制备的单克隆抗体为CDV感染动物的治疗和基因工程抗体的开发奠定了基础。     

貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

采集大庆某貉养殖场病貉的病料,处理后接种于非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离。对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定,并用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染细胞中的病毒核酸。病料接种 Vero 细胞 72 h 后产生明显的细胞病变(CPE);病毒分离株可以被犬瘟热病毒阳性血清中和,中和效价为 1∶25;分离株对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,可以凝集鸡红细胞,其凝集作用可被犬瘟热病毒阳性血清所抑制; RT-PCR检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长287 bp,与预期设计的长度相同,经测序发现与MS01株的同源性为99%。结果表明,分离的病毒株为犬瘟热病毒,命名为CDV-DQ株。     

犬瘟热—犬冠状病毒双重PCR诊断方法的建立及初步应用

Two pairs of PCR primers were designed according to sequence of canine distemper virus （CDV） and canine coronavirus （CCV） from GenBank, respectively, which could amplify 550 bp fragment for CDV and 225 bp fragment for CCV. The products of PCR were cloned to pMD18-T for sequencing, which proved to be specific. Positive plasma were developed for standard DNA, and the sensitivity result of duplex PCR showed that the method could amplify 0.1 ng/μL nucleic acid for both of viruses. The result of rudimentary application showed that the method was specific, sensitive, efficient, and was a new detecting method for the mixed infection of CDV and CCV.     

用半套式PCR检测犬瘟热病毒的研究

根据ＧｅｎＢａｎＫ中Ｂａｒｒｅｔｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列,设计合成了能扩增７６０ｂｐ基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍－－酚－－仿一步抽取法提取细胞总ＲＡＮ进行反转录,再以此产物进行半套式ＰＣＲ扩增,并筛选出最佳ＰＣＲ扩增。结果经半套式ＰＣＲ扩增能得到与设计片段大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验     

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。     

犬瘟热荧光抗体技术的应用研究

用硫酸铵盐析法和蔗糖梯度离心法，从犬瘟热病毒人工感染犬的肝，脾中浓度提纯犬瘟热病毒，以其免疫家兔，制备兔抗犬瘟热病毒免疫血清，再经硫酸铵沉淀与ＱＡＥ－葡聚糖凝胶Ａ５０层析提取ＩｇＧ，于４℃低速搅拌标记异硫氰酸荧光素，制成兔抗犬瘟热病毒抗原荧光抗体。用上述荧光抗体检测２１只犬瘟热病毒人工感染犬和３５只自然感染犬的１１６份白细胞，抗原阳性１０９份，而健康犬，传染性肝炎犬，犬细小病毒肠炎犬的３７份血液白     

犬瘟热的诊断及其预防免疫的研究进展

本文对犬瘟热（CD）的诊断、预防免疫和免疫失败的影响因素及犬瘟热病毒（CDV）的宿主范围进行了综述。CDV不仅感染陆生食肉动物，而且也感染水生食肉动物，并且其宿主范围还在不断扩大。CDV感染主要采用病毒分离、特异性病毒抗原或特异性核酸检测等方法确诊。疫苗包括灭活的CDV疫苗、麻疹病毒（MV）异源苗及CDV弱毒活苗。疫苗接种犬的免疫反应主要取决于毒株特性及犬的应答能力，只有弱毒活苗能诱导产生持久而坚强的保护力。尽管多年来CDV弱毒活苗的使用控制了CD的发生，但最近免疫过的犬发生CD的病例并不少见。分析免疫失败的原因，主要是母源抗体干扰、疫苗质量差、其它病毒的免疫抑制以及CDV流行株可能发生了变异等因素的影响。     

犬瘟热病毒自然感染宠物犬不同部位检出率的分析

本试验利用RT-PCR检测方法对犬瘟热病毒(CDV)自然感染宠物犬的不同部位样品进行检测,确定CDV在感染犬组织中的分布情况。对14只CDV阳性犬的血液、眼分泌物、鼻液、唾液、粪便和尿液进行检测,RT-PCR方法检出的阳性率分别为92.9%、85.7%、100%、85.7%、100%和66.7%,结果显示粪便和鼻液样品的检出率最高,检出率达100%,宜于作为检测对象取材。     

犬瘟热弱毒株CDV3生物学特性鉴定

以SPF鸡胚成纤维细胞 (CEF)从国外引进的疫苗中分离到犬瘟热弱毒株CDV3 。对犬瘟热弱毒株CDV3 的理化特性 ,细胞病变规律 ,病毒毒价 ,核酸型、血清学交叉反应 ,试验动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验 ,结果表明 ,犬瘟热弱毒株CDV3 可作为狐犬瘟热疫苗生产用毒种。     

犬瘟热病毒免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体消长规律的研究

试验旨在了解产蛋鸡对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)抗原的免疫反应及其血清抗体和卵黄抗体的消长规律,为制备卵黄抗体提供依据。将CDV接种Vero细胞和DF1细胞进行传代并测定其病毒滴度,选取细胞病变出现早、病毒滴度高的Vero细胞毒作为接种病毒抗原免疫蛋鸡。每10 d免疫蛋鸡1次,第4次免疫后每30 d加强免疫1次。免疫前及免疫后每10 d采血分离血清,每5 d收集鸡蛋提取卵黄抗体,用琼脂扩散法和间接ELISA法测定其抗体水平。结果显示,血清抗体比卵黄抗体的滴度高,两者呈正相关性,卵黄抗体出现较血清抗体迟3~5 d,卵黄抗体在第3次免疫后3~5 d就已达到较高水平,此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。     

狐源犬瘟热病毒的分离及RT-PCR鉴定

为开展犬瘟热疫苗研究的前期工作,采用Vero细胞分离病毒的方法,选择保守基因N基因做RT-PCR鉴定,结果表明,该方法可成功分离出病毒并扩增出861 bp片段,与预计的片段大小一致。     

犬瘟热病毒在MA-104、Marc-145、Vero3种细胞内增殖效果的比较

试验比较了MA-104、Marc-145、Vero 3种猴肾细胞增殖犬瘟热病毒的敏感性,按常规方法将犬瘟热病毒(CDV-XN112株)分别接种于MA-104、Marc-145、Vero 3种细胞,通过观察细胞病变,确定收毒时间,比较病毒滴度。结果表明,犬瘟热病毒可在MA-104、Marc-145、Vero 3种细胞内增殖,并出现典型细胞病变,效价均达到104.5TCID50/0.1mL以上,而Vero细胞增殖犬瘟热病毒更为经济高效,是增殖该病毒的理想细胞。     

RT-PCR检测宠物犬的犬瘟热病毒

为了寻找一种在早期快速准确检测宠物犬犬瘟热病毒(CDV)的方法,从临床上疑似CDV感染犬抗凝血中分离出血淋巴细胞,从中提取总RNA,引用曾在警犬上成功检测到CDV的引物序列,反复摸索RT-PCR反应条件,经凝胶电泳观察到在理论设计处(287 bp)出现了光亮条带,说明已成功地从宠物犬中检测出CDV。表明该引物序列和改良的RT-PCR反应条件适合于检测宠物犬CDV感染。     

急性犬瘟热感染组织脏器的研究

临床中犬瘟热多分为急性和亚急性,3月龄犬多发本病,急性病例和亚急性病例的临床症状和病毒复制的脏器与慢性病例有很大区别。临床上急性病例的病变主要集中在肺脏和淋巴组织,组织病理学可观察到淋巴结炎和多核巨细胞性肺炎。根据免疫组织化学染色结果发现,在犬瘟热急性病例的淋巴结皮质中犬瘟热抗原呈强阳性,且密度很高。而病犬虽然表现出严重的肺炎症状,但在犬的肺脏中犬瘟热病毒抗原阳性反应弱,仅在支气管上皮和少量的巨噬细胞胞浆中观察到。犬瘟热病毒首先在犬的淋巴组织中进行复制、增殖,破坏被膜下淋巴窦和淋巴小节中的T淋巴细胞和B淋巴细胞,影响淋巴组织输出到外周血液循环中的淋巴细胞数量。本研究结果表明,犬瘟热虽然临床上以肺脏病变最严重,但在急性和亚急性病例,犬瘟热病毒主要在淋巴组织的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞中增殖,故应以淋巴组织作为犬瘟热病毒的主要分离脏器。     

核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用

根据犬瘟热病毒（CDV）基因序列的结构特点,在其编码核衣壳蛋白的高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物.以RT-PCR技术从CDV基因中扩增出了一段长度为430 bp的核苷酸cDNA,并制备出地高辛标记的CDV核酸探针.特异性检测结果表明,该探针能与CDV标准株和地方分离株核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、MV等病毒的核酸杂交反应均为阴性.敏感性检测结果表明,该探针对CDV的检出量可达到0.1 pg.用所制备的核酸探针对某宠物诊所疑似犬瘟热病例进行临床诊断初步应用试验,表明该标记探针完全可用于CDV的临床检测.