利用ITS和AFLP标记探讨中国、日本和澳大利亚3种珠母贝的亲缘关系

我国合浦珠母贝 Pinctada fucata 的命名较混乱,与日本的 P.fucata martensii 和澳大利亚的 P.imbricata 的分类关系存在争议。用 ITSs 序列和 AFLP 标记对这3个种的遗传关系进行了分析。结果表明这3个地理种的遗传分化很低,种内和种间的遗传距离相互重叠,AFLP 数据的聚类分析表明澳大利亚种群大部分个体单独聚合成一支,主成分分析结果相似。种问的遗传距离与分化程度与其地理距离呈正相关。分子方差结果也表明种间的差异较小,低于6%。这些结果表明这3个种实际上是同一物种。由于大西洋的 P.imbricata 与澳大利亚的不同,因此根据分类命名的优先原则,正确的种名应为 P.fucata。     

合浦珠母贝C-型凝集素基因的序列特征和功能分析

通过EST筛选结合重测序法获得合浦珠母贝一种C-型凝集素cDNA的全长序列(命名为PoLEC1)。PoLEC1全长988 bp,5′-UTR为33 bp,3′-UTR为101 bp,开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸,分子量为31.68 ku,理论等电点约5.83。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met¹-Ser¹⁹)和糖结合位点。同源性分析结果表明,PoLEC1与其它物种C-型凝集素的的糖识别结构域序列的同源性在18.8%~28.6%,相似性在28.9%~50.0%之间。进化树分析结果表明,PoLEC1与栉孔扇贝聚为一支。组织表达分析表明,PoLEC1 mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠、鳃和血淋巴组织均有表达,在消化腺中的表达分析表明,经溶藻弧菌刺激后2 h表达显著下调,而在4和24 h后表达显著上调。利用PoLEC1成熟肽构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组表达。制备包涵体后,用IDA HisBind 树脂纯化得到单一的重组蛋白,凝菌试验表明该蛋白对大肠杆菌有明显的凝集作用。     

合浦珠母贝DNA的抽提和RAPD反应体系的优化

分别从保存于-70℃和95%乙醇的合浦珠母贝组织提取总DNA。结果表明,乙醇保存标本用双蒸馏水预处理后所提的DNA与-70℃保存的标本所提的DNA质量均较好。用抽提的DNA为模板优化RAPD条件,得到适合于合浦珠母贝的RAPDPCR反应条件为:20μL反应体系中包括20ngDNA模板,1×PCRBuffer,0.1mmol·L-1dNTPs,2.5mmol·L-1MgCl2,0.2μmol·L-1引物,1UTaqDNA聚合酶。最佳退火温度40℃。PCR产物用非变性PAGE银染和琼脂糖EB染色检测所得到的主要带型相同,但PAGE能检测到更多的多态带。     

褐牙鲆(♀)、夏鲆(♂)及其杂交子一代的ITS1序列特征分析

以雌褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、雄夏鲆(P.dentatus)及其子一代为研究对象,对其核糖体基因的ITS1序列进行比较分析。结果表明,ITS1序列具有明显的种间及个体内差异。在雄夏鲆ITS1序列中仅发现1种基因类型(X型),而在雌褐牙鲆及子一代ITS1序列中发现两种差异显著的基因型(X型和Y型)。在亲本中未检测到两种类型的交换重组序列,而在子代中检测到4个X型与Y型的重组序列,说明子代ITS1区域更容易发生交换重组。进一步的遗传距离分析发现,母本与子代之间的遗传距离(0.059)明显大于父本与子代之间的遗传距离(0.018),且子代中X型片段出现的频率(85.5%)远大于Y型片段出现频率(8.7%),表明亲本双方ITS1区域的遗传信息都遗传给了子代并且X型片段的遗传信息明显占有优势,进而从分子水平上证明子代为褐牙鲆与夏鲆的杂交后代。本研究旨在分析牙鲆属亲本及子代的ITS1序列特征,为鱼类核糖体基因的研究积累数据。     

合浦珠母贝不同壳色选育系F6数量性状的相关性和通径分析

为深入了解不同壳色合浦珠母贝(Pinctada fucata)形态性状与体重间的关系,为亲贝的选择提供策略,本研究使用合浦珠母贝传统壳色、金壳色、白壳色、红壳色和黑壳色5种壳色选育系F6各1000只个体的性状数据进行通径分析和聚类分析。测量的性状包括壳长(SL,mm)、壳高(SH,mm)、壳宽(SW,mm)、绞合线长(HL,mm)和体重(BW,g)。结果显示,5种壳色合浦珠母贝所有形态性状与体重间的相关系数均达到极显著(P0.01)。通径分析表明,壳长对传统壳色和白壳色贝体重的直接影响最大,壳高对金壳色和红壳色贝体重的直接影响最大,壳宽对黑壳色贝体重的直接影响最大。利用多元回归方法构建不同壳色合浦珠母贝形态性状与体重(BW,g)间的回归方程,其中传统壳色:BW=-24.999+0.467SL+0.387SH-0.259SW+0.244HL;金壳色:BW=-38.661+0.305SL+0.477SH+0.242SW+0.375HL;白壳色:BW=-4.130+0.332SL+0.300SH-0.307SW+0.088HL;红壳色:BW=-27.307+0.327SL+0.321SH+0.252SW+0.305HL;黑壳色:BW=-40.921+0.278SL+0.335SH+1.076SW+0.269HL。聚类分析显示,传统壳色与金壳色形态特征相近,而白壳色、红壳色和黑壳色形态特征相近。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用,对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析,结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间,可以分为ITS1区,5.8S区和ITS2区3个部分,其中5.8S区片段的长度完全一致,均为160 bp;ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近,只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异,序列同源性在95.82％~99.73％之间,而5.8S区序列则完全一致,但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异,序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

澳大利亚塔斯马尼亚地区大西洋鲑、河鳟、虹鳟和溪红点鲑的线粒体DNA核苷酸序列之差异

过去一直应用线粒体基因组独有的特点研究物种种群动态和起源的特征。在塔斯马尼亚大西洋鲑鱼或虹鳟鱼的线粒体基因组样品中找不出限制位点的差异。鲑鱼中mtDNA变化的缺乏可能是暂时产生的，但是至关重要的，它可以减少塔斯马尼亚孵化场的亲鱼群体数量。由于在新西兰、澳大利亚大陆和塔斯马尼亚地区孵化场人工繁殖和野生自然繁殖交替进行，虹鳟的mtDNA可能有了低水平的变化。河鳟的淡水种群和降海种群具有相同的线粒体基因组，尽管搭期把尼亚引进许多北半球品系，可以推断它们每一种鱼均携带其自己特有的mtDNA。结合前人的论证考虑，有人认识只有1864年首次引进的几百尾河鳟形成了适应性种群，而且在这一种群中少量的母系说明了检测中mtDNA变化的不足。在仅18尾塔斯马尼亚鱼样中发现两个溪红点鲑单模标本，它提示人们，这个河鳟品系是1962年引入塔斯马尼亚的，具有较大的mtDNA变化，与孵化场无关。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。     

刀鲚MOR-2AK2的克隆、序列分析及组织表达

嗅觉是鱼类感知周围环境的重要工具,可能参与生殖洄游的过程。嗅觉由嗅觉受体(olfactory receptor)基因所编码的受体蛋白识别气味分子所引发,主嗅觉受体(MOR)基因是数量最大的一类嗅觉基因,可识别水溶性气味分子。为了弄清刀鲚定居型与洄游型种群的主嗅觉基因差异,本研究通过RACE技术获得了洄游型刀鲚MOR-2AK2基因,其开放阅读框长度972 bp,为单外显子结构,可编码323个氨基酸残基。预测表明,MOR-2AK2基因所编码的蛋白为7个疏水性的α-螺旋跨膜结构,属于G-蛋白偶联受体。对10种组织所作的定量分析表明,MOR–2AK2基因在嗅囊和性腺中的表达量远远高于其他组织器官,并且嗅囊中的表达量还高于性腺中的7~25倍。MOR–2AK2基因的表达量也存在性别差异,其中雌性嗅囊中的表达量约为雄性中的2倍,但精巢中的表达量却约是卵巢中的2倍。序列分析显示,MOR–2AK2基因的5′-UTR区域存在着一段微卫星序列(GT)5,其中定居型多出洄游型14个碱基(GTGTGTGTGTGTTT),这导致了二者所编码的氨基酸序列的相似度仅为84%。这些结果表明,MOR–2AK2基因不但与嗅觉功能有关,也可能参与了刀鲚的性腺发育或生殖洄游过程,同时也可能与定居型种群的形成相关。     

马氏珠母贝选育群体4个世代的遗传变异

采用9个多态性微卫星位点分析马氏珠母贝(Pinctada fucata)壳高选育品系(JCS)4个世代的遗传多样性与遗传结构的变化。结果表明, 随着选育的进行,  4个世代每个位点的平均有效等位基因数(N_e)从2.096下降至1.435, 平均等位基因丰度(R_s)从3.556下降至 2.556, 平均观测杂合度从0.492渐次下降至0.269, 遗传多样性呈明显的下降趋势。随着选育世代的增加, 从等位基因频率的变化来看, 部分呈上升趋势, 部分呈下降趋势, 部分基本保持稳定, 其中, 一些低频基因甚至会趋于消失。在所有等位基因中, 大部分的频率呈随机变化趋势, 并在不同的世代间上下波动; HHM20- 158 bp的频率呈有规律的变化, 由中高频逐步上升至高频, 呈富集趋势。结论认为, 经过4代的选育, 马氏珠母贝选育群体遗传多样性呈降低趋势, 遗传结构趋于稳定。本研究旨在为后续的马氏珠母贝选育策略提供理论指导。

     

Identification,Characterization, and Evaluation of Polymorphic Microsatellite Markers for Parentage Assignment in Pinctada fucata

Parentage analysis is a useful tool for establishing pedigree relationships in selective breeding. In this study, 31 microsatellite markers were tested, and 13 loci were subsequently used to identify parenthood in Pinctada fucata. According to simulation analysis, the power of nine loci to exclude false parents was 99.94%, and that of 10 loci was 99.95%. Moreover, using 10 loci and known parental and filial information, the cumulative assignment success rate to one true parental pair was as high as 99%. Of the 120 progeny tested, 93.3% were exclusively assigned to their parental pairs in mixed pedigrees. These results suggested that these microsatellite markers can be used for rapid and effective parentage assignment and contribute to the selective breeding of P. fucata.     

合浦珠母贝实时定量PCR内参基因的稳定性比较

以合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）和18S核糖体rRNA（18S rRNA）3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。     

16SrDNA序列分析鉴定一株合浦珠母贝共附生乳酸菌

从合浦珠母贝（Pinctada fucata）粘液中分离纯化得到一株抗菌物质产生菌F9,利用16SrDNA方法鉴定该菌株为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）。通过琼脂扩散法测定了该菌的抑菌谱,发现该菌发酵液上清液在排除有机酸和过氧化氢（H2O2）的影响后仍对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）等多种食源性致病菌有明显的抑菌作用。对该菌发酵液抑菌物质进行超滤分析及蛋白酶处理,可推断该抗菌物质为分子量在5～10kDa的蛋白类物质。     

Common pearl oysters in China, Japan, and Australia are conspecific: evidence from ITS sequences and AFLP

ABSTRACT:   To elucidate the species status of Pinctada fucata in China, P. fucata martensii in Japan and P. imbricata in Australia, one population of each taxon was studied using internal transcribed spacer 1 and 2 (ITS1, and ITS2) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. ITS1 and ITS2 were 401–405 and 229–237 bp long, respectively. Twenty-nine ITS1 and 15 ITS2 unique genotypes were obtained from 44 and 34 individuals, respectively, with some genotypes shared by two or three populations. In AFLP analysis, each individual exhibited a distinct phenotype. No population had diagnostic markers. Mean genetic divergences within and among the three populations were very low and overlapped (between-population: 0.7–0.9% for ITS1, 0.9–1.3% for ITS2, and 53.3–55.6% for AFLP; within-population: 0.5–0.9% for ITS1, 0.8–1.2% for ITS2, and 50.4–53.6% for AFLP). Low levels of genetic differentiation were observed among the three populations while the Australian population is partially genetically isolated. Under an infinite allele model, genetic differentiation among populations was not significant based on a permutation test. Under an infinite site model, most F _ST values were not significant for ITS data although they were significant for AFLP data. Network analysis using ITS data indicated that individuals from the same population did not cluster together. Analysis of molecular variance ( amova ) demonstrated that > 94% variation was contributed by within-population variation. These findings suggest that the three taxa are conspecific and Pinctada fucata is the correct name.     

合浦珠母贝选育家系的遗传多样性分析

该研究选取具有多态性的6对微卫星引物对构建的2批合浦珠母贝(Pinctada fucata)完全双列杂交家系的遗传多样性进行了分析。6个微卫星标记在9个家系360个个体中共检测到32个等位基因,有效等位基因(Ne)为1.758 7~3.586 5,观测杂合度(Ho)为0.144 4~0.488 9,期望杂合度(He)为0.432 0~0.722 2,Shannon指数(I)为0.691 9~1.507 4。9个家系都有单态位点,平均Ho为0.129 2~0.466 7,平均He为0.155 0~0.439 6,平均I为0.248 5~0.712 2。有19个位点(占35.19%)极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡。各家系之间的遗传距离为0.109 0~1.137 2,遗传相似性系数为0.320 7~0.896 8。家系L4B46与L4B48的遗传距离最大,与D3D313的遗传距离最小。UPGMA法聚类分析显示,9个家系分为3支,L4B48单独成一支,B4D426、B4D427与D4B445聚成一支,其余家系聚成一支。该研究结果为合浦珠母贝家系选择育种的亲本选择与交配设计提供了科学依据。     

盐度和温度对大珠母贝与合浦珠母贝滤水率和摄食率的影响

利用静水清滤法研究了盐度和温度对大珠母贝（Pinctada maxima）与合浦珠母贝（Pinctada fucata）稚贝滤水率和摄食率的影响。试验分为4组,大1组：大珠母贝壳长（1.02±0.07）cm,大2组：大珠母贝壳长（2.94±0.17）cm;合1组：合浦珠母贝壳长（1.15±0.21）cm、合2组：合浦珠母贝壳长（3.08±0.36）cm。结果表明,随着盐度或温度的增加,4个组的滤水率和摄食率均先升高,到达最大值后又降低;其中,大1组在盐度27有最大滤水率(0.274±0.079) L/h,合1组在盐度30有最大滤水率(0.325±0.011) L/h,二者无显著性差异（P>0.05）,大2组与合2组均在盐度33时有最大滤水率,分别为（0.660±0.027）L/h,（0.329±0.021）L/h,二者有显著性差异（P<0.05）。大珠母贝稚贝在盐度30时摄食率最大,合浦珠母贝在盐度33时摄食率最大,二者有显著性差异（P<0.05）。两种稚贝在26℃时,滤水率和摄食率达到最大值,二者的最大滤水率之间或最大摄食率之间均有显著性差异（P<0.05）;随着贝体生长,大珠母贝的滤水率和摄食率显著高于合浦珠母贝,因此饵料需求量也更大;饵料不足可能是大珠母贝稚贝死亡的重要因素。     

合浦珠母贝3个养殖群体遗传多样性的微卫星分析

采用微卫星分子标记对我国广东大亚湾、广西北海、海南三亚的合浦珠母贝养殖群体进行了遗传多样性分析.从49对引物中筛选出31对有效扩增引物,种群扩增获得9个多态位点,多态位点比例为29.03%.它们在3个群体共96个个体中产生了44个等位基因,平均每个位点产生4.889个.3个群体的平均期望杂合度分别为0.590、0.600、0.615;平均观察杂合度分别是0.393、0.425、0.325;平均多态信息含量PIC值分别是0.530、0.551、0.556.表明3个群体的遗传多样性处于较高水平.平均遗传偏离指数分别为-0.324、-0.336、-0.304;哈代-温伯格平衡检测发现,3个群体27个位点中21个位点偏离平衡状态.遗传分化和遗传距离分析表明,海南群体与广东群体之间的亲缘关系较近,而与广西群体的亲缘关系较远.