旱稻孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对旱稻孢囊线虫ISSR–PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物)在4个用量水平上进行优化试验。结果表明,旱稻孢囊线虫ISSR–PCR最佳的反应体系为:在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL﹑模板DNA 1μL﹑d NTPs(2.5 mmol/L)2μL﹑引物(10μmol/L)1μL﹑10×PCR Buffer(20 mmol/L Mg2+plus)2.5μL。引物UBC887最适退火温度为48℃。优化的旱稻孢囊线虫ISSR–PCR的反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

大叶石上莲ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立并优化大叶石上莲(Oreocharis benthamii)ISSR-PCR反应体系,采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA,利用正交试验设计方法,从Mg~(2+)、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平,对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系:2.0μL的10×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTP,0.7μmol/L引物,2.0 U TaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板(20μL反应体系)。在此基础上,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。     

薄壳山核桃ISSR-PCR反应体系的优化

采用正交试验设计,对薄壳山核桃ISSR - PCR反应体系的主要影响因子(TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、Mg2+和模板DNA)进行了优化,并得到了适合薄壳山核桃的ISSR - PCR扩增体系.结果表明,在20μL的ISSR - PCR反应体系中,1.0U的Taq酶、0.4 mmol/L的dNTP、0.2 μmol/L的引物、2.0 mmol/L的Mg2+和40ηg的模板DNA为适合薄壳山核桃的最佳反应条件.     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

山核桃ISSR反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取山核桃基因组DNA,该方法提取的DNA纯度与含量较高。以宁国山核桃居群为试材,用引物UBC810[序列为（GA）8T]研究了PCR反应体系的5种主要组分对山核桃ISSR扩增结果的影响。结果显示：除模板DNA含量外,其它因素均对扩增效果有明显影响。建立的反应体系为：20μL反应体系中DNA模板量30ng、引物浓度0.3μmol/L、dNTPs浓度0.3mmol/L、Mg2＋浓度2.0mmol/L、TaqDNA聚合酶用量1U。     

树莓基因组DNA的提取及ISSR反应体系的正交优化

以树莓优良野生种质插田泡(Rubus coreanus)为材料,比较了SDS法、CTAB法和改良CTAB法提取树莓基因组DNA的效果,结果发现三种方法均能提取到树莓DNA,但改良CTAB法优于CTAB法和SDS法,其所得的DNA质量最好,杂质最少.通过正交试验设计,对Taq酶,primer,dNTP和DNA用量进行了筛选,建立了树莓ISSR技术最优反应体系,即25μl反应体系中含有1 ×PCR Buffer,2 mmol/LMg2+,1.5 U Taq酶,0.2 μmol/L primer,0.4 mmol/L dNTP和20 ng DNA.采用引物UBC835和UBC873分别对10个树莓品种和8个树莓野生资源进行检验发现,该体系工作效果良好.     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

田野菟丝子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对田野菟丝子的遗传多样性进行了研究,通过筛选引物并对影响PCR扩增效果的一些因素如Mg2 浓度、牛血清白蛋白浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、TaqDNA聚合酶用量以及退火温度等指标进行优化,建立了可用于田野菟丝子ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,2.0mg/ml牛血清白蛋白,0.2 mmol/L4×dNTP,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 UTaqDNA聚合酶。引物UBC811的最适退火温度为50.7℃。     

正交设计优化荷花品种ISSR-PCR反应体系

以东方明珠荷花为试验材料,应用L9(34)正交设计,探讨反应体系中引物、Taq DNA聚合酶等4个不同因素的3个水平对荷花品种反应体系的影响,正交设计所用引物为UBC843,PCR结果应用MINITAB软件进行方差分析和极差分析。结果表明,荷花最佳ISSR-PCR反应体系(25μL):2.5μL 10×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L d NTPs,0.40μmol/L引物,20~80 ng模板DNA,1.00 U Taq DNA聚合酶。优化的ISSR-PCR反应体系稳定性高、重复性较好,为从分子水平对荷花品种进行各项研究奠定了基础。     

辣木RAPD最佳反应体系的构建

[目的]研究辣木（Moringa oleifera Lamarch．）PAPD最佳反应体系,为辣木RAPD扩增提供研究基础。[方法]以辣木为研究材料,通过正交设计建立辣木RAPD最佳反应体系。[结果]辣木最佳RAPD反应体系为：10×PCR Buffer 2．5μl,Taq酶0．5μl（2．0U／μl）,dNTPs4．0μl（2．0mmol／L）,primer 4．0μl（2．0μmol／L）,DNA2．0μl（30．0ng／μl）,ddH2O 12．0μl;反应总体积为25．0μl。[结论]RAPD可以应用于辣木研究。     

棉花DNA提取及优化SSR反应体系的建立和应用

对棉花DNA提取程序和SSR反应体系进行了研究。利用正交设计对模板DNA、引物、Taq酶和Mg^2＋浓度4种成分以3个梯度进行优化和选择,结果表明,最优反应体系为15μL,其中含有：10×Taq buffer 1．5μL、Mg^2＋（25mmol／μL）1．5肛L、dNTPs（25mmol／μL）2．0μL、引物（20pmol／μL）各2．0μL、Taq酶（2．0U／μL）0．15μL、DNA模板（25ng）3．0μL、ddH2O补至15μL。采用建立的反应体系,利用8对引物对3个品种进行扩增,6％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果显示该体系扩增结果清晰稳定。     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证

研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响,建立番茄ISSR- PCR反应的优化体系,为ISSR 技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。实验确定番茄ISSR-PCR 20 μL反应体系为：2.0 μL 10×PCR缓冲液,0.3 μmol/L引物,50 ng模板DNA,0.5 mmol/LdNTP,2 U TaqDNA聚合酶,各引物最佳退火温度有所不同。     

甘草RAPD-PCR反应体系正交优化研究

[目的]建立一套适合甘草分子学研究的RAPD-PCR反应体系。[方法]以甘草种质为试材,采用正交试验法设计,对影响RAPD-PCR扩增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板进行优化筛选。[结果]总体积25μl的甘草RAPD-PCR最佳反应体系为：10×PCR缓冲液（含MgCl2）2.5μl,10 mmol/L dNTPs 2.5μl,50 ng DNA 2.0μl,10μmol/L引物2.0μl,5 U/μl Taq酶0.4μl。对引物的退火温度进行了梯度筛选,34℃时扩增效果较好。[结论]进行甘草RAPD-PCR反应体系的正交优化非常有效。     

黑龙江林蛙ISSR反应体系的建立与优化

以黑龙江林蛙为材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,对引物的最佳退火温度进行选择,建立适合黑龙江林蛙的ISSR-PCR分析的最佳体系:在25μL总体积中,包含10×PCR Buffer 2.5μL,Mg2+4.0 mmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,引物0.3μmol.L-1,TaqDNA聚合酶0.5 U,DNA模板2.0 ng.μL-1,最佳退火温度53.8℃。为利用该技术对黑龙江林蛙遗传多样性分析和构建遗传图谱提供一定的依据。     

槟榔SSR反应体系的建立

以鸡心槟榔为试材,用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit提取基因组DNA,对SSR反应体系进行建立与优化,探讨了槟榔SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响。最终确定了引物C7549的最佳退火温度为56℃,在PCR反应体系中最佳条件:Mg2+浓度为3.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.1 mmol/L,Taq酶量为1.5 U,引物浓度为0.8μmol/L,DNA模板为2.0 ng/μL。利用此反应体系对部分槟榔品种进行PCR扩增并Page胶电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合槟榔的亲缘关系分析。     

枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化

以不同生长期的枣和酸枣为研究对象,采用CTAB法提取枣基因组DNA;通过单因素5水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了枣和酸枣RAPD技术最优体系,即25μl反应体系中各组分含量为10×Taq Buffer+KCl 2.5μl;Taq DNA聚合酶0.04 U/μl;MgCl22.0 mmol/L;模板DNA2 ng/μl;引物0.3μmol/L;dNTP为0.2 mmol/L。适宜的扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃循环变性50 s,36℃退火50 s,72℃延伸1.5 min,38个循环;72℃延伸10 min。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

獭兔RAPD反应体系优化研究

对獭兔RAPD体系中Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、基因组DNA浓度进行研究。结果表明:Taq酶浓度为1.0 U,引物浓度为10 pmol/μl,基因组DNA浓度为50 ng/μl时,可获得清晰、稳定性好的条带。优化的RAPD反应体系为:总体积为20.0μl。10×Buffer(含Mg2+)为2.0μl;dNTPs(各2.5 mmol/L)为2.0μl;Taq酶浓度为1.0 U,引物浓度为10 pmol/μl,基因组DNA浓度为50 ng/μl;超纯水为13.8μl。PCR扩增条件为:97℃预变性7 m in,94℃1 m in,36℃退火1 m in,72℃2 m in,45个循环后,在72℃延伸10 m in结束,4℃保存。PCR扩增产物通过1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。点样后,以2~3 V/cm电压降稳压电泳3.0~3.5 h。     

大蒜SSR体系的建立与优化

为建立适宜大蒜(Allium sativum L.)的SSR反应体系和扩增程序,应用L16(45)正交设计对影响SSR-PCR的主要参数进行优化。结果表明,适宜大蒜的SSR反应体系总体积为20μL,其中含TaqDNA聚合酶0.02 U/μL、引物为0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、DNA 30 mg/L;PCR适宜扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃45 s,72℃延伸90 s,35次循环,94℃变性30 s,53℃45 s,72℃延伸1 min,10次循环的最后一个循环延伸增加为10 min。并优化引物最适合退火温度为53.5~58.5℃。利用此反应体系对40份大蒜品种进行SSR扩增并电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,证明此体系稳定可靠。在此基础上,利用优化的SSR反应体系对100对大葱SSR引物进行筛选,从中筛选出1对扩增谱带清晰稳定性好的SSR引物,并对40份大蒜品种进行遗传多样性分析。这一对SSR引物共检测出3个多态性条带可将供试材料聚为2大类,大部分品种(系)都按照其地理来源和遗传背景进行聚类。