黄芩苷对H6N6禽流感感染小鼠肺损伤的影响

为探究黄芩苷对H6N6禽流感病毒感染小鼠肺损伤的影响,选取108只昆明小鼠,随机平均分为6组(对照组、阳性组、西药组和低、中、高剂量黄芩苷组)。攻毒3 d后用不同剂量黄芩苷连续治疗9 d,各组在第3,6,9天时随机选6只小鼠,取其肺脏进行病理观察及HE染色制作切片,检测肺组织病毒含量及小鼠血清中IL-1、TNF-α、IFN-γ和5-HT含量。结果表明：攻毒3 d后,相比对照组,其余各组小鼠肺脏出现病理损伤;治疗3 d时,相比阳性组,高剂量黄芩苷组小鼠肺脏指数、病理评分和病毒含量均显著降低(P<0.05),治疗6 d时,相比阳性组,低、中、高剂量黄芩苷组小鼠血清中IL-1、TNF-α、5-HT含量均极显著降低(P<0.01),中、高剂量黄芩苷组IFN-γ均极显著升高(P<0.01);相比西药组,高剂量黄芩苷组小鼠肺脏指数、病理评分、病毒含量及血清中IL-2含量均无显著差异(P>0.05)。说明黄芩苷通过降低病毒在肺脏中的复制,调节血清中炎性因子(IL-1、TNF-α、IFN-γ和5-HT)含量,减轻H6N6禽流感患鼠肺的损伤。     

黄芩苷对自噬介导H6N6禽流感病毒致病损伤的作用

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用。选用40只昆明小鼠随机分为4组,即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组。通过HE染色观察肺组织病理形态学变化,ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α的含量,透射电镜检测小鼠肺脏中自噬体的水平,Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平,免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平,免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平,RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平。结果显示,经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤,血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α含量显著下降(P<0.01),肺组织中自噬体数量减少,LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P<0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P<0.01)。结...     

鸡源H9N2亚型禽流感病毒感染鸡鸭和小鼠后对血液指标的影响

流感可以跨种属传播,通过了解地方性低致病禽流感H9N2亚型病毒感染不同种属动物后的血液变化情况,可为研究禽流感病毒的致病机制提供参考依据。选用52d黑羽乌骨鸡24只,52d樱桃谷鸭24只,6周龄～8周龄昆明系小鼠24只分成3组,攻毒前作为0d空白对照,鸡、鸭和小鼠采用静脉注射感染H9N2亚型流感病毒,分别在感染前(0d)、感染后3d、6d、9d采样,用PE-6800VET三分类动物血细胞分析仪测定血液常规指标。通过对不同种类白细胞和血小板数量变化的分析,结果表明,低致病性禽流感病毒H9N2可以跨种属感染,鸭炎性反应最小,小鼠炎性反应最严重。     

黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响

为研究黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响,并为黄芩苷应用于防治鼠伤寒沙门氏菌疾病提供试验依据。采用最小抑菌浓度、抑菌圈和细菌生物膜测定等体外试验,检测体外黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响;通过建立鼠伤寒沙门氏菌感染模型,将ICR小鼠腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌1 010 CFU/ml·只,同时腹腔注射黄芩苷按1 g/kg连续给药7 d,观察黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗效果。结果表明,黄芩苷的浓度在1.6、8、40、200μg/ml时,对鼠伤寒沙门氏菌的生长无抑制作用;浓度为1.6、8、40、200μg/ml时,均无抑菌圈生成;浓度为1.6、8、40、200μg/ml时,可以显著抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜的形成;黄芩苷按1 g/kg连续给药7 d,可以明显延长鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的存活时间。结论：黄芩苷可以降低鼠伤寒沙门氏菌活性,可以应用于防治鼠伤寒沙门氏菌疾病。     

黄芩苷对大肠杆菌细胞通透性的影响

本试验旨在探索黄芩苷对大肠杆菌的抑菌机制。在测定黄芩苷对大肠杆菌的最小抑菌浓度和生长曲线的基础上,通过测定菌液电导率和碱性磷酸酶含量,研究黄芩苷对大肠杆菌细胞通透性的影响。试验结果表明,黄芩苷对大肠杆菌具有明显的抑菌效果,其最小抑菌浓度为6.25 mg/mL;黄芩苷可引起大肠杆菌菌液的电导率和碱性磷酸酶含量明显升高。证实了黄芩苷通过增加大肠杆菌细胞膜与细胞壁通透性,从而发挥抑菌作用。     

HPLC法测定黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷的含量

为了建立HPLC法测定黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷的含量方法,在CLC-ODSC18柱上,以甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)为流动相,检测波长280 nm,以外标法定量测定了黄芩苷-β-环糊精包合物黄芩苷的含量.结果:线性范围为20.0～80.0μg/ml,回归方程为Y=9753.1X 1546,r=0.9993(n=5),平均加样回收率为99.37%(n=5),精密度试验RSD为0.30%(n=6).本方法准确、可靠、重现性好,可作为黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷的含量测定方法.     

HPLC法测定黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷的含量

建立了用HPLC测定黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷含量的方法.色谱柱为CLC-ODS C18柱,以甲醇-水-磷酸(47∶ 53∶ 0.2)为流动相,检测波长280 nm,外标法定量.检测的线性范围为20.0～80.0 μg/mL,回归方程为y=9 753.1 x 1 546, r=0.999 3(n=5),平均加样回收率为99.37%(n=5),RSD为0.67%(n=6).本方法准确、可靠、重现性好,可作为黄芩苷-β-环糊精包合物中黄芩苷的含量测定方法.     

组胺受体拮抗剂对低致病性禽流感患鸡血液指标的影响

为了研究组胺受体拮抗剂对低致病性禽流感病毒(LPAIV)感染黑脚麻鸡后的患鸡血液学的影响,探讨组胺受体1(H1)、组胺受体2(H2)在低致病性禽流感发生发展过程中的作用,试验选用120只1日龄黑脚麻鸡,育雏至1月龄后每日早晚分别注射0.4 mL/kg的组胺受体拮抗剂或生理盐水,并通过滴鼻感染禽流感病毒H9N2(107EID50),具体分为4组,阴性组(灭菌生理盐水)、阳性组(灭菌生理盐水+H9N2)、扑尔敏(扑尔敏+H9N2)组和西咪替丁(西咪替丁+H9N2)组,分别在第37、44、51日龄采血,测定血液指标。结果显示:扑尔敏组血液中白细胞数量、淋巴细胞数量在37和51日龄时均极显著(P0.01)高于西咪替丁组和阳性组;第44日龄阳性组白细胞数量、淋巴细胞数量极显著(P0.01)高于阴性组和扑尔敏组。37和51日龄时阳性组红细胞数量、血红蛋白浓度、红细胞体积和血小板含量均极显著(P0.01)低于阴性组和扑尔敏组;44日龄时阳性组红细胞数量、红细胞体积和血红蛋白浓度极显著(P0.01)低于阴性组和扑尔敏组,而阳性组和西咪替丁组血小板含量极显著(P0.01)高于阴性组和扑尔敏组。结果表明:扑尔敏能够稳定低致病性禽流感患鸡血液中白细胞数量、淋巴细胞数量、红细胞相关指标和血小板数量,西咪替丁效果不显著。     

黄芩苷对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

氧化应激是阻碍胚胎体外发育的重要因素之一,减少氧化应激可能是提高胚胎体外培养效果的途径。本文探讨了不同浓度黄芩苷对小鼠卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,为体外抗氧化性研究及抗氧化物选择提供参考。试验选择4～6周龄雌性昆明小鼠获取GV期卵母细胞,在体外成熟培养液中分别添加不同浓度(0、20、40、60μmol/L)的黄芩苷,经37℃、5%CO₂、饱和湿度培养条件体外成熟12 h,统计卵母细胞第一极体排出率,检测卵母细胞胞质内活性氧(ROS)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及培养液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC),并采集8～10周龄雄性昆明小鼠精液,进行体外受精(IVF),分别于受精后6、24、96 h统计受精率、卵裂率和囊胚率。结果表明：体外成熟液中添加40、60μmol/L黄芩苷后,卵母细胞第一极体排出率较对照组显著提高(P<0.05),且浓度为40μmol/L极体排出率显著高于60μmol/L,但对成熟后的卵母细胞体外受精率、卵裂率、囊胚率无显著性影响(P>0.05),卵母细胞胞质RO...     

黄芩苷对猪致病菌的体外抗菌试验

采用微量稀释法分别测定黄芩苷对链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)值。结果显示,黄芩苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为16μg/m L,对链球菌的MIC为64μg/m L,对沙门氏菌和巴氏杆菌无明显抑菌性。说明黄芩苷对猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,对链球菌的抑菌性较差,对沙门氏菌和巴氏杆菌无明显抑菌性。     

1株鸭源H4N6亚型流感病毒全基因组序列测定和遗传演化分析

2010年在山东水禽市场健康鸭体内分离鉴定1株H4N6亚型流感病毒（AⅣ）,命名为A／duck／shandong／1／2010（H4N6）（缩写为DK／SD／1／2010）。对其全基因序列进行测定,并与GenBank中相关序列进行遗传演化分析。结果表明：DK／SD／1／2010HA基因切割位点附近的氨基酸序列（PKKASR↓GLF）符合低致病力AIV的特征;HA基因与A／avian／Japan／8k10185／2008（H4N6）在同一进化分支内;PB2基因与A／Mallard／Hokkaido／24／2009（HSN1）在同一分支内;NP基因与A／Spot-billedduck／Korean／546／2008（H6N1）在同一分支内;M基因与A／Dintail／Aomori／1130／2008（HIN3）在同一分支内。因此,推测DK／SD／1／2010可能是不同来源的流感病毒基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

不同H9N2亚型禽流感病毒株致病力的比较试验

参照NDV评价毒力的方法对1998—2008年间收集的25株H9N2AIV的致病性进行了比较研究。结果显示,25株H9N2AIV不同毒株间致病性有较大差异,大致分为3类：致病性偏强、致病性中等和致病性较弱。从中选出致病力有差异的8个毒株进行了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种指数（IVPI）以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果证明大部分毒株ICPI和IVPI基本上为0,排毒散毒的高峰期在攻毒后第5天到第6天。在25个毒株中,3#和12#表现出了比较高的致病性,不仅其EID50值最高（分别为10-8.8/0.2mL和10-8.8/0.2mL）、ELD50值最高（分别为10-7.9/0.2mL和10-8.7/0.2mL）,而且鸡胚平均死亡时间也最短（分别为66.5,69h）。3#、12#还出现了1日龄雏鸡脑内接种指数（分别为0.238,0.437）和6周鸡静脉内接种指数（分别为0.34,0.51）。在8周龄SPF鸡人工感染排毒试验中3#和12#毒株的排毒量大,排毒时间也明显长于其他毒株（第2～9天）。以上试验结果表明我国H9N2AIV不同毒株致病性有明显差异,呈多态性,致病性偏强的毒株造成鸡群较高的死亡率。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。     

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

对1998—2002年间在河南省豫北地区分离到的5株H9N2亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究。经HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验及攻毒保护试验证明，5株H9N2亚型间已经发生了抗原性漂移。98A5和99S毒株间的保护力接近100％，HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验的相关性均在0．74以上。表明2毒株间的抗原性相近；用00Y毒株攻击其他4株免疫的鸡，其保护率仅为60％～80％；而02Y株对除00Y株外的4株的免疫保护率分别为60％、75％、80％、100％，与分离年代呈负相关性，HI、鸡胚中和试验、细胞中和试验也取得类似结果，说明2000年后的毒株间已发生抗原性变异。     

两株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导细胞凋亡的研究

为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用，我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A／Duck／Guangdong／40／2000（H5NI）（简称DKGD／40／00）和A／Duck／Guangxi／35／2001（H5NI）（简称DKGX／35／01）的NSI基因克隆到真核表达载体plRES2-EGFP，转染Hela细胞后，应用荧光显微镜检测转染表达效率，应用TUNEL和流式细胞仪观察NSI基因产生的细胞凋亡作用。结果两株病毒NSI蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡，凋亡率无明显差异。表明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。     

H9N2禽流感病毒分离株NS基因同源性分析

经RT-PCR扩增了三株国内H9N2亚型禽流感病毒(ATV)分离株的非结构(NS)蛋白基因,并把扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体中测序,获得了NS1和NS2蛋白的完整编码序列.经与GenBank中发表的核苷酸序列比较表明,这三株病毒的NS基因之间的同源性为96%～98%;与1994年以来香港、韩国H9N2亚型分离株NS基因的同源性均在90%以上;其NSI蛋白的C-末端都缺失13个氨基酸,不同于香港分离株;在AIV NS基因系统发育进化树中,三者都处于等位基因A类的亚洲禽-猪群分枝.     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体，研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法，用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件，确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度，对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析，并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明，该方法敏感、特异，具有良好的重复性和稳定性，可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究

2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。