猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

鸽圆环病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Rep保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测.结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1.43×102～1.43×108 c...     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法.该方法对7.87×103～7.87×109拷贝/μL的PCV3标准质...     

应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Ⅱ型猪圆环病毒

Ⅱ型猪圆环病毒（porcine circovirus type2，PCV-2）为近年来引起多种综合征的重要病原，且经常与猪呼吸与繁殖障碍综合症、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒发生混合感染。建立对于该病毒的快速检测及准确定量的方法，无疑对于病原诊断及病因学研究具有重要的意义。实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光PCR检测方法建立及应用

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,目前基因型分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4.但在临床上,PCV2和PCV3流行较多,且鉴于PCV2和PCV3高度相似的临床特征,因此,建立一种快速、可靠的可同时检测PCV2和PCV3的方法,对PCV的临床诊断和流行病学调查意义深远.本研究利用生物信息学软件,设计2对引物和2...     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

检测猪圆环病毒2型SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

检测猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立

猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2（开放阅读框2）基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green I荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪细小病毒株NADL-2(NC001718)的VP2基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增出431bp的目的片段。回收产物与pMD18-T vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为标准模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,R2=0.997 6,产物Tm为82.3～82.9℃,检测灵敏度为72.1拷贝/μL,特异性和重复性良好。本试验所建立的检测PPV VP2基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为该病毒的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度奠定了基础。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

猪圆环病毒2型竞争定量PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型(PCV2)BF的序列设计引物,扩增472 bp的ORF2部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建含PCV2-ORF2部分基因片段的重组质粒.利用Xba I限制性内切酶消化后获得共用同1对引物但缺失196 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子间的竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪PCV2-ORF2的标准竞争曲线和直线回归方程,并对PCV2试验感染猪血清中PCV2核酸的动态变化进行了研究.     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

检测猪圆环病毒DNA的竞争定量PCR方法的建立及初步应用

建立了定量检测猪圆环病毒DNA的竞争PCR方法.应用PCR扩增PCV-2 ORF2上490 bp片段P3P4,克隆到pMD 18-T载体获得目标模板.构建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的竞争模板,其携带与目标DNA和靶DNA相同的引物结合区.以定量的竞争模板同一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,以产物的荧光强度(IOD)绘制标准曲线,结果当反应体系中起始模板的量为1.0×107 cop/μL,循环次数小于或等于30时,原始模板数以指数增长.由此确定目标模板和竞争模板的最适工作浓度并用该方法检测感染细胞内的PCV-2基因组的拷贝数和临床样品中的PCV-2 DNA含量,结果发现临床样品中的PCV-2 DNA含量达到一定程度(肺中1.0145×108 copies/mL,血中0.8×107 copies/mL,淋巴中9.698×108 copies/mL),猪表现临床症状,而病毒在感染细胞内的复制在80 h基因的拷贝数达到最高,这为今后的研究奠定了基础.