利用随机肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位

利用噬菌体随机12肽库对抗猪瘟病毒（classical swine fever virus CSFV）糖蛋白E2特异的单抗A11进行表位鉴定，经过4轮筛选后，随机挑取10个噬菌体克隆作竞争ELISA检测。结果表明，10个克隆中除4号克隆外，其余9个均能抑制原核表达的E2蛋白和A1l单抗之间的抗原抗体反应，抑制率在35％～64％；DNA测序表明，所有产生竞争抑制作用的8个噬菌体克隆的12肽序列均舍有XXWRXXXL核心序列，而没有抑制作用的克隆则不含该核心序列；Western-blot试验证明，所挑阳性克隆均能被单抗A11识别。多序列比较发现，该核心序列与猪瘟病毒E蛋白的28～35位氨基酸TTWKEYSH有一定的同源性，人工合成的含有部分核心序列氨基酸的多肽可以与单抗A11反应，表明单抗A11所针对的抗原表位位于CSFVE2蛋白的28～35位氨基酸。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的研究

蛋白质抗原表位 (抗原决定簇 )是蛋白质抗原性的物质基础 ,一个蛋白质分子可带有多个不同的抗原决定簇 ,即抗原表位 (epitopes)。通常 ,抗原表位是指氨基酸序列已经清楚的抗原决定簇。蛋白质抗原表位的研究 ,对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。B细胞蛋白抗原表位的预测自从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来 ,已有许多参数、算法发表 [1～10],对B细胞蛋白抗原表位研究起到了巨大的推动作用。本文就猪瘟病毒(SFV)E2蛋白抗原表位的研究概况作一介绍。1猪瘟病毒E2抗…     

猪瘟病毒E2蛋白研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。目前该病流行于除北美洲和大洋洲以外的其他大洲和地区,呈世界性分布,在一些原已宣布消灭猪瘟的欧洲国家（荷兰、比利时、英国、德国、意大利、西班牙等）又相继复发。虽然我国长期坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但目前猪瘟在我国依然存在,流行特点从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发,隐性持续性感染病例增多,因此应明确猪瘟病毒的基因组结构和最具免疫防制研究价值的抗原蛋白结构,为研制新型有效的疫苗和诊断试剂提供理论依据。本文就猪瘟病毒的基因组结构、猪瘟病毒E2蛋白的结构、功能、所包含的抗原表位以及E2蛋白的表达应用等方面的研究进展作以综述。     

猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化

为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

猪瘟病毒EO、E2蛋白抗原表位的研究进展

猪瘟(classical swine fever CSF或hog cholera HC)是严重危害我国和世界各国养猪业的烈性传染病,国际兽役局将其列为A类6种法定传染病之一.根据粮农组织-国际兽疫局-世界卫生组织(FAO-OIE-WHO)<动物卫生年鉴>(1992年)公布的资料,全世界仍有44个国家存在猪瘟.近年来,该病在美洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现广泛流行的趋势,一些宣布已消灭了猪瘟的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟复发的报道[1].     

猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究

利用基因搭桥技术，在Klenow DNA聚合酶作用下，分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因，并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定，构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下.实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GSTD、GST-E)，以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实：E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性，而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GSTD，但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明：融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能，为多表位疫苗的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因的克隆与鉴定

根据猪瘟病毒Brescia株全基因序列设计合成特异性引物对P1/P2对，采用异硫氰酸胍一步法（略加修改），从PK15细胞培养物中提取石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株猪瘟病毒的总RNA。应用RT-PCR方法成功地扩增出E2全基因组约1273bp的cDNA片断，经电泳证明其大小与推测相符。分别将石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株的E2基因片段克隆到pGEM-T载体质粒，通过对这4个重组质粒的EcoRI酶切鉴定、直接与套式PCR扩增，并对E2主要抗原区域进行224bp的序列测定，表明E2全基因克隆成功，为E2全序列测定和结构与功能的分析奠定了基础。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗的制备及对家兔的免疫效果

猪瘟病毒E2蛋白不但具有很强的保护性,而且与病毒毒力密切相关。本研究旨在利用基因工程技术,原核表达纯化猪瘟病毒E2蛋白并对其进行N-糖基化修饰,以使其靶向树突状细胞,从而增加其免疫效力。结果表明,经间苯二酚硫酸法及质谱分析鉴定,猪瘟病毒E2蛋白质ε-赖氨酸成功进行了体外糖基化修饰。进而将糖基化E2蛋白质免疫家兔,首免后14d进行第二次免疫,分别在不同时间采血制备血清,经ELISA检测,免疫7d,糖基化E2蛋白质组抗体水平显著高于猪瘟病毒组与E2蛋白质组(P<0.01);至14d时,糖基化E2蛋白质组抗体水平开始下降,与疫苗组、E2蛋白质组相比差异不显著(P>0.05);在二免后14d,糖基化E2蛋白质组抗体水平上升至最高水平,显著高于猪瘟疫苗组和E2蛋白质组(P<0.01);至二免后21d,糖基化E2蛋白质组抗体水平略高于猪瘟疫苗组(P>0.05),显著高于E2蛋白质组(P<0.05);至二免后28d,糖基化E2蛋白质组抗体水平达到稳定值,显著高于另2组(P<0.05)。结果说明,糖基化E2蛋白质免疫后有效诱导了机体的抗体反应,抗体产生快而持久,具有良好的免疫记忆,免疫效果显著优于常规疫苗,是新型疫苗开发的优选抗原,具有很深的开发潜力。     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

CSFV囊膜蛋白E2单克隆抗体识别表(拟)位基序的差异性分析

CSFV囊膜糖蛋白E2是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.本研究应用抗CSFV(Alfort毒株)E2蛋白的单克隆抗体c2410、WH303及M1669,筛选噬菌体展示的12肽随机肽库,进行表位分析.结果发现:c2410、WH303针对同一线性表位,精确定位于E2蛋白的832～837位氨基酸SPTTLR,是CSFV特异性表位.同时发现WH303识别的2个主要拟位基序:(W)NKPxT、AxWPTA,M1669识别的3个主要拟位基序:DxMRLD、(SL)MPPF、MLLHxxPxL,但在E2蛋白中均未查找到与之相同(似)序列.应用ELISA、竞争性ELISA、免疫印迹分析不同表(拟)位对单克隆抗体的免疫反应性差异,结果发现:(1)c2410对WH303的3个噬菌体拟位(WNKPxT,AxWPxATA,SPSxLR)在ELISA、免疫印迹检测中均为阴性;(2)SPTxLR噬菌体拟位能与c2410、WH303发生特异性结合,且此结合能被病毒抗原阻断;(3)M1669的3个噬菌体拟位(DxMRLD,(SL)MPPF、MLLHxxPxL)在ELISA、免疫印迹中能与M1669发生特异性结合,但此结合不能被病毒抗原阻断.     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

Generation and efficacy evaluation of a recombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swine fever virus

Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of classical swine fever (CSF), which causes significant economic losses to the pig industry worldwide. The E2 glycoprotein of CSFV is the main target for neutralizing antibodies. This study was aimed to develop a recombinant human adenovirus type 5 expressing the CSFV E2 gene (rAdV-E2) and evaluate its efficacy in rabbits and pigs. The results showed that the rabbits and the pigs immunized with the rAdV-E2 developed high-level CSFV-specific neutralizing antibodies. The rAdV-E2-immunized rabbits were protected from fever induced by infection with C-strain, which is pathogenic to the rabbit, and the rAdV-E2-immunized pigs were protected from lethal challenge with highly virulent Shimen strain. This indicates that the recombinant adenovirus can be an attractive candidate vaccine for preventing CSF.     

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主丝/苏氨酸蛋白激酶N1相互作用的鉴定

为筛选并鉴定与猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术以CSFV C蛋白为诱饵从猪外周血单个核细胞(PBMC)c DNA表达文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白,共筛选到6种蛋白,分别为ATP5B、SON3、PKN1、PCBP1、RPS20和IQGAP1,根据Gene Ontology分析结果,这些蛋白分别参与细胞的增殖和代谢等过程。本研究选取丝/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)进行进一步验证,经酵母共转化试验、免疫共沉淀试验和GST pull-down试验证实,宿主PKN1蛋白与CSFV C蛋白之间存在特异性结合。本研究首次证明PKN1与CSFV蛋白之间的相互作用关系,为进一步研究PKN1蛋白在CSFV感染过程中发挥的作用奠定了基础。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

Yeast-expressed classical swine fever virus glycoprotein E2 induces a protective immune response

Classical swine fever (CSF) is an economically important swine disease worldwide. The glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV) is a viral antigen that can induce a protective immune response against CSF. A recombinant E2 protein was constructed using the yeast Pichia pastoris expression system and evaluated for its vaccine efficacy. The yeast-expressed E2 (yE2) was shown to have N-linked glycosylation and to form homodimer molecules. Four 6-week-old specified-pathogen-free (SPF) piglets were intramuscularly immunized with yE2 twice at 3-week intervals. All yE2-vaccinated pigs could mount an anamnestic response after booster vaccination with neutralizing antibody titers ranging from 1:96 to 1:768. Neutralizing antibody titers at 10 weeks post booster vaccination ranged from 1:16 to 1:64. At this time, the pigs were subjected to challenge infection with a dose of 1 × 10⁵ TCID₅₀ (50% tissue culture infective dose) virulent CSFV strain. At 1 week post challenge infection, all of the yE2-immunized pigs were alive and without symptoms or signs of CSF. Neutralizing antibody titers at this time ranged from 1:4,800 to 1:12,800 and even to 1:51,200 one week later. In contrast, the control pigs continuously exhibited signs of CSF and had to be euthanized because of severe clinical symptoms at 6 days post challenge infection. All of the yE2-vaccinated pigs were E^rns antibody negative and had seroconverted against E^rns by post challenge day 11, suggesting that yE2 is a potential DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) vaccine. The yeast-expressed E2 protein retains correct immunogenicity and is able to induce a protective immune response against CSFV infection.     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。