秦川牛CEBPA基因遗传变异对体尺和胴体性状的影响

试验以CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)为候选基因,采用直接测序的方法寻找秦川牛CEBPA基因SNP,筛查到一个新的多态位点T963G,该突变位于基因的编码区。运用PCR-RFLP方法验证并分析该位点在215头秦川牛群体中的多态性。结果表明:在秦川牛群体中分布A、B 2个等位基因,处于中度多态。经过χ2适合性检验,秦川牛群体在该位点达到Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。将该T963G位点的基因型与体尺、胴体性状进行关联分析,表明该位点与胴体重显著相关(P0.05),BB为有利基因型,B等位基因为有利等位基因,提示该位点有可能作为秦川牛胴体性状标记辅助选择的标记之一。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

深县猪mtDNA CytB基因的遗传多样性与母系起源研究

 研究过氧化物酶体增殖激活受体α (PPARα) 基因第7外显子SNP位点与牛的部分胴体、肉质性状的相关性。以6个牛品种(秦川牛、南阳牛、郏县红牛、鲁西牛、安格斯、夏南牛) 共计717个个体为研究对象,采用PCR SSCP结合DNA测序方法对PPARα基因第7外显子进行SNP检测,并该SNP位点与108头秦川牛的部分胴体、肉质性状的相关性进行分析。结果发现在PPARα基因第7外显子的184位检测到C→T突变,在南阳牛、秦川牛、郏县红牛、安格斯、鲁西牛、夏南牛这6个群体中等位基因E/F的频率分别是0.225/0.775,0.151/0.849,0.125/0.875,0.123/0.877,0.070/0.930, 0.157/0.783;遗传学指标结果显示：秦川牛、郏县红牛、安格斯、鲁西牛和夏南牛这5个群体属于低度多态(PIC<0.25),南阳牛为中度多态（PIC=0.288）;相关分析结果显示：该位点与秦川牛的背膘厚和胴体长两个性状显著相关,表现为FF基因型个体在背膘厚性状方面显著高于EE和EF基因型个体(P<0.05),FF基因型个体的胴体长显著高于EE基因型个体(P<0.05)。这一位点可能是影响牛背膘厚和胴体长的主效QTN或与之紧密连锁,可做为肉牛选育的候选分子标记。     

中国红牛苹果酸酶(ME1)基因3′UTR的克隆及多态性分析

试验鉴定了牛苹果酸酶(ME1)基因3′UTR的选择性转录及单核苷酸多态性(SNPs),并对其与中国红牛肉质性状和胴体性状的相关性进行了分析。试验克隆了ME1基因3′UTR的2个转录体(片段大小不同)。ME1-DraI酶切分析结果发现3′UTR存在1个SNP,且该位点与中国红牛蒸煮损失、pH24h、眼肌面积显著相关(P<0.05)。因此,该位点可作为中国红牛肉质性状和胴体性状的分子标记辅助常规育种位点。     

鸡CAST基因5′侧翼区G-198A突变对启动子转录活性的影响

钙蛋白酶抑制蛋白在宰后嫩度和肌原纤维更新过程中起着关键的作用。为探讨CAST基因启动区G-198A突变位点不同基因型启动子活性,构建鸡CAST基因5′调控区CAST517序列的不同基因型双荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-CAST517/promoter),采用脂质体转染法将不同基因型报告基因表达载体质粒(pGL3-CAST517G/promoter和pGL3-CAST517A/promoter)、空白对照质粒(pGL3-Basic)和海肾荧光素酶载体质粒pRL-CMV共转染至293T细胞,利用t检验法分析不同基因型的启动子活性,在线工具对CAST517序列结合位点和转录因子进行预测,分析转录水平。结果显示,CAST517A作为启动子时,萤火虫对海肾荧光素酶的强度比值要比使用CAST517G启动子效率提高113.89%,呈高效表达(P0.01);在线预测结果显示,CAST517序列存在1个类似TATA盒、1个转录起点、3个潜在的顺式调控原件(PR、ER和GATA-1)和1个潜在的反式调控原件(TGGCA-binding)。携带CAST517A的个体具有较高的转录水平,说明该基因可能对鸡肉质性状有一定的调控作用,研究结果为CAST基因的表达和功能及优质肉鸡的选育提供了可靠依据。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4(Tβ4)基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155～-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降(P0.05)。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

中国西门塔尔牛GH基因SNPs与经济性状的关联分析

本试验采用PCR-RFLP和DNA测序等技术检测牛生长激素基因P3位点(growth hormone,GH-P3)在中国西门塔尔牛群体中的多态性,并利用最小二乘法拟合线性模型对该位点与牛经济性状进行关联分析。结果表明,BB基因型个体胴体重和净肉重极显著高于AA和AB基因型个体(P<0.01),屠宰率和净肉率显著高于AA和AB基因型(P<0.05),AA基因型背膘厚极显著低于AB、BB基因型(P<0.01)。本研究结果显示,GH-P3位点对中国西门塔尔牛个体胴体重、屠宰率、净肉重、净肉率及背膘厚等经济性状有显著或极显著的影响,为中国西门塔尔牛重要经济性状的分子标记辅助选择(MAS)及品系培育提供理论依据。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

牛MyoD1基因遗传变异及其对胴体性状的影响

运用DNA池快速测序法寻找牛MyoD1基因SNPs，筛查到1个新的多态位点C1867T，该位点C-T突变引起甘氨酸/丝氨酸的转变。运用PCR RFLP法验证并分析该位点在不同群体间的多态性, 并与相应牛群体的胴体性状进行关联分析。结果显示，中国西门塔尔牛、鲁西牛群体的C1867T位点的突变达到了Hardy-Weinberg 平衡状态，而秦川牛未达到平衡状态。不同基因型对肉牛的背膘厚、大腿肉厚的影响差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05)，对日增重、屠宰率、肌间脂肪、大理石花纹、嫩度的影响差异不显著。     

阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠肠黏膜屏障的影响

作者旨在研究阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O1大鼠肠黏膜机械屏障、免疫屏障和化学屏障的影响。选用60只6～8周龄SD大鼠进行试验,分为空白对照组、未治疗组、环丙沙星组和阿如拉-7味散高(1.08g·kg^-1)、中(0.54g·kg^-1)、低(0.27g·kg^-1)剂量组,共6组,每组10只。试验结束时,计算其保护率,并采集小肠各段进行HE染色,测定小肠黏膜形态指标;同时采集血清和回肠组织,ELISA试剂盒法检测血清中的D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)含量以及回肠黏膜中的分泌型免疫球蛋白(sIgA)和肠三叶因子(ITF)含量。结果表明:(1)阿如拉-7味散中剂量对感染致病性E.coli O_1大鼠的保护率最好,为50%;且对小肠黏膜形态有一定的改善和修复作用,其效果与环丙沙星相当;(2)环丙沙星组与空白对照组相比D-乳酸含量无显著差异(P>0.05);阿如拉-7味散高、中剂量组DAO含量与空白对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)除阿如拉-7味散低剂量组外,其余各组与未治疗组相比回肠黏膜sIgA含量显著提高(P<0.05);未治疗组大鼠回肠黏膜ITF含量与其余各组相比显著降低(P<0.05)。结果提示,阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠引起的肠黏膜损伤有一定的修复作用,其中中剂量(0.54g·kg^-1)效果最佳,与抗生素环丙沙星的修复效果相当。     

埃博拉病毒抗体间接血凝检测方法的建立

以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒中和试验检测结果相比较。结果显示,该方法可特异性检测EBOV抗体,与马尔堡病毒、裂谷热病毒等的阳性血清均不发生反应;与假病毒中和试验测得的抗体效价增长规律相一致。结果表明,本试验成功建立了EBOV抗体间接血凝检测方法,该方法安全、简便、快捷,为EBOV疫苗免疫后的效果评价提供了又一新的检测方法。     

比格犬皮肤病病原的分离与鉴定

对青岛某犬场一例比格犬皮肤病患犬进行了病原的分离培养以及鉴定。经过皮肤局部观察、寄生虫检查、真菌分离及18SrRNA基因测序、细菌分离及16SrRNA基因测序,结果显示本病例主要致病原因是寄生虫、细菌和真菌的混合感染,其中寄生虫感染以蠕形螨为主,细菌病原包括中间型葡萄球菌、链球菌和乳酸菌,真菌病原主要有隐球菌、青霉菌和念珠菌。调查结果为临床治疗提供了理论依据。     

女贞子多糖抑制MDA缓解CCl_4致小鼠肝损伤

本研究应用女贞子多糖给小鼠饮水,探讨其对四氯化碳诱导肝损伤的保护作用。试验分为对照组、模型组、女贞子多糖高、中、低剂量组和阳性药组,通过检测各组小鼠的生长性能、肝脏指数、血清生化指标和丙二醛(MDA)的表达量,综合评估女贞子多糖的保肝作用。结果表明:与模型组相比较,饮水中添加不同剂量的女贞子多糖对小鼠生长性能无影响(P>0.05),但可以显著缓解四氯化碳所致的肝脏指数(P<0.05)、肝功能指标(P<0.05)和肝脏血清MDA含量(P<0.05)。饮水中添加女贞子多糖可以有效缓解小鼠化学性肝损伤,这可能与调节肝脏MDA的表达,抑制脂质过氧化反应有关。     

蒙古马自然感染马鼻狂蝇蛆的细胞免疫反应研究

为了探索马鼻狂蝇蛆感染蒙古马的免疫学机制,在呼和浩特市屠宰场采集感染马鼻狂蝇蝇蛆的4头蒙古马的咽部和扁桃体组织,同时收集2头健康蒙古马作为对照组,制作常规石蜡切片,通过HE染色和免疫组化试验,对咽部和扁桃体组织T淋巴细胞(CD3^+)、B淋巴细胞(CD20^+)、巨噬细胞(CD68^+)进行分析。结果显示:感染组咽部黏膜的黏膜下层有虫卵肉芽肿形成,咽部黏膜存在大量的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞;免疫组化显示,与对照组相比,感染组咽部组织内CD3^+细胞显著上升(P<0. 05),CD20^+、CD68^+细胞极显著上升(P<0. 01);感染组扁桃体内的CD20^+细胞显著上升(P <0. 05),CD3^+、CD68^+细胞极显著上升(P<0. 01)。结果表明:感染马鼻狂蝇蛆后蒙古马出现了Ⅰ型超敏反应和Ⅳ型超敏反应,T、B淋巴细胞及巨噬细胞增多表明机体获得性免疫反应发挥了作用,并可能产生了针对马鼻狂蝇蝇蛆的特异性免疫球蛋白。     

LINC24065在体细胞核移植牛中的异常表达

旨在揭示DLK1-DIO3印记域上一个新的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)LINC24065在自然繁殖牛(natural reproduction,NR)与体细胞核移植牛(somatic cell nuclear transfer,SCNT)中的组织表达与印记状态,对进一步了解DLK1-DIO3印记域在供体核重编程中的作用提供一定的理论基础。本研究以自然繁殖牛的大脑组织为试验材料,利用RACE和RT-PCR技术,在牛的DLK1-DIO3印记域内鉴定了一个新的印记的lncRNA基因,命名为LINC24065。用基于SNP(single nucleotide polymopisms)的RT-PCR产物直接测序方法分析LINC24065在自然繁殖牛和体细胞核移植牛组织中的表达及印记状态。序列分析发现,LINC24065编码6个可变剪接体,并在自然繁殖牛被检测的7个组织中都表达,而在体细胞核移植牛组织中没有检测到可变剪接体LINC24065-V3,且其它5个剪接体呈现组织特异性表达。印记状态分析发现,LINC24065在自然繁殖牛和体细胞核移植牛的7个组织中均为单等位基因表达,但在体细胞核移植牛的大脑组织中出现了与其他组织亲本来源不同的单等位基因表达。研究结果说明,LINC24065基因在体细胞核移植牛的大脑中出现了印记紊乱,并且剪接体在组织中的表达也发生了改变。以上研究结果说明LINC24065基因与体细胞核移植牛的发育异常有关。     

mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒对B16动物模型的抑瘤作用

为探讨双启动子调控HN基因重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN对小鼠黑色素瘤动物模型的抑瘤作用,试验构建B16裸鼠皮下移植瘤模型,采用HEK293细胞扩增重组腺病毒,进行纯化和滴度检测。将重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN、Ad-GFP和PBS通过尾静脉注射裸鼠,冰冻切片观察裸鼠肿瘤内GFP绿色荧光表达情况,通过肿瘤生长和裸鼠存活情况计算抑瘤率,探究其在体内的抗肿瘤作用。结果显示:重组腺病毒在HEK293细胞中扩增,滴度分别为10^11.250,10^12.250,10^10.625,10^12.125,10^12.250 TCID50/mL;肿瘤组织中能观察到黑色素细胞,证明皮下黑色素移植瘤模型构建成功;重组腺病毒对脏器无损伤,且在双启动子组脏器中没有观察到黑色素细胞的肝肺转移;通过尾静脉注射重组腺病毒后能够在肿瘤中观察到荧光表达;与其他组相比双启动子组重组腺病毒不但能抑制黑色素瘤的生长,而且能延长裸鼠的生存期,抑瘤率为55.5%。因此,该重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN具有靶向性,并且可以抑制肿瘤生长,可为黑色素瘤的治疗提供参考。     

ELISA测定猪尿液中β-受体激动剂残留的准确性评价

本研究建立克伦特罗间接竞争ELISA检测方法,对检测条件进行了优化确定,并利用猪尿液进行添加回收试验。结果显示:ELISA反应CLE-OVA包被抗原和CLE单抗的最适浓度分别为1:40 000和1:20 000,间接竞争ELISA的线性范围为0.016 l^8.520 0 ng/mL。该方法对克伦特罗、溴氯特罗、马布特罗和溴布特罗均有交叉反应。对冷冻储存半年以上的猪尿进行ELISA测定时,发现检测限可达58.848 3 ng/mL,药物添加回收率为85.19%~5 173.25%,变异系数为4.78%~96.79%;而经过MCX固相萃取柱净化处理后,检测限为0.076 ng/mL,添加回收率在101.21%~119.10%之间,变异系数为6.05%~18.38%。结果表明,SPE净化处理后,可有效去除尿液中的色素、蛋白等基质,提高了该法的灵敏度和准确性。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。