伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达.SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET3...     

PRV SD株gE基因主要抗原区域原核表达及间接ELISA方法的建立

参考猪伪狂犬病病毒(PRV)SD株g E基因序列,设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含g E主要抗原表位编码区的618 bp片段,将其用Bam HⅠ和Xho L I双酶切后,插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达、SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和纯化;利用表达的PRV SD g E蛋白进行g E-ELISA鉴别检测方法研究。结果发现:gE重组蛋白得到了高效表达,融合蛋白的分子量约为42ku;表达产物存在于上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,并且能被PRV抗体所识别。将纯化后的g E蛋白作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪Ig G为二抗,建立检测PRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:确定的抗原最佳包被浓度为36μg/m L,最佳包被时间为37℃、1 h并4℃过夜,待检血清(1:50稀释)37℃作用1 h,二抗(1:3 000)37℃作用1 h。重复性试验、交叉试验证明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。用g E-ELISA和IDEXX g E-ELISA同时对采集的92份猪血清进行平行检测,发现该方法的特异性为85.71%,敏感性为90.63%,二者符合率为89.13%。该方法为我国猪伪狂犬病的鉴别监测提供了一种可供选择的技术手段。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在获得重组伪狂犬病病毒（PRV）gE蛋白及其多克隆抗体。利用PCR方法从PRV感染猪的肺脏、脑和扁桃体混合组织中扩增PRV gE基因,连接至克隆载体pMD18-T（pMD-gE）后进行测序与进化树分析。以pMD-gE为模板,利用PCR方法扩增其膜外结构域部分基因（gE-outside）,将其连接至原核表达载体pET-30a（+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-gE-outside。将重组质粒pET-gE-outside转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行表达产物的分析与鉴定。经亲和层析技术纯化重组PRV gE蛋白并免疫小鼠,通过间接ELISA和Western blotting分别进行三免3周血清中鼠抗PRV gE多克隆抗体效价的测定和鉴定。PCR和测序结果表明,本研究成功克隆了PRV gE基因,与国内2011年以后流行毒株属于相同分支。SDS-PAGE和Western blotting结果证实,PRV gE-outside基因在原核表达系统获得正确表达,分子质量约为55 ku,且可与猪抗PRV多克隆抗体发生免疫反应。经亲和层析纯化的gE-outside蛋白浓度为1.23 mg/mL。将其免疫小鼠,三免3周的小鼠血清中鼠抗PRV gE-outside多克隆抗体效价为1：204 800,并可与gE-outside蛋白发生免疫反应。综上,本研究制备了重组PRV gE蛋白和鼠抗PRV gE蛋白多克隆抗体,可为PRV感染机制研究及建立快速、高效免疫学检测技术提供技术指导和材料。     

某规模化猪场PRV gE抗体的检测与分析

利用gE-ELISA技术对闽南某规模化猪场共51份血清进行PRV gE抗体检测.检测结果表明,不同猪群PRV gE抗体阳性率存在差异,能繁母猪群PRV gE抗体阳性率较育肥猪高.并对猪场防控猪伪狂犬病提出建议和对策.     

猪伪狂犬病病毒gE 37～243蛋白的原核表达及gE蛋白抗体间接ELISA的建立

gE蛋白是鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染和gE基因缺失疫苗免疫的首选靶标.本研究利用大肠杆菌表达系统获得了可溶性表达的gE37～243蛋白,并以纯化的gE37～243蛋白为包被抗原建立了检测PRV gE抗体的间接ELISA方法.结果 显示,该方法的敏感性和特异性分别为93.33％和93.75％,批内和批间变异系数...     

猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,研制出了猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,并与国内市场标杆产品进行比较,发现阳性符合率为88.03%,阴性符合率为91.47%,总体符合率达到89.84%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。该检测试剂盒的研制,可为猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测提供技术支撑。     

间接ELISA快速检测猪PRV抗体方法的建立

用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化伪狂犬病病毒(PRV)作抗原,建立了检测PRV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为3.2 mg/L,血清最佳稀释度为1∶80。试验结果表明,间接ELISA检测PRV抗体具有快速、敏感、特异等特点,适合于大量样品的检测,对畜群免疫效果的检测和免疫程序的制定有重要意义。     

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒gE基因主要表位区的表达及gE-ELISA方法的建立

根据GenBank中登录的猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因序列,设计特异性表达引物,扩增gE富含B细胞表位的一段编码序列。扩增片段通过BamH I和Sal I酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,重组表达质粒所含的gE基因读码框正确。重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测表明,gE基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物约为28 ku的融合蛋白,能与PRV感染动物血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。以纯化的gE蛋白为包被抗原,建立了ELISA检测方法。本试验为我国实施伪狂犬病的扑灭计划提供了必要的手段。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因在大肠杆菌中的表达及gE-ELISA鉴别诊断方法的建立

试验以pPGEDNA为模板，用1对分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的伪狂犬病病毒gE基因特异性引物，扩增出约1．7kb的含完整gE基因的DNA片段；目的片段经EcoR I和BamH I双酶切后，插入原核表达载体pBV220得到重组表达质粒pBVgE，并转化大肠杆菌DH5a；对温敏诱导表达所获产物进行SDS—PAGE、Western—Blot和琼脂双扩散检测。结果表明，gE糖蛋白得到了高效表达，表达产物约占总蛋白的17％。为了鉴别伪狂犬病疫苗免疫猪和自然感染猪，用表达纯化的gE蛋白为抗原，建立了GE—ELISA方法。选定的反应条件包括GE抗原包被浓度为6.6mg／L，血清最适稀释度为1：40。测试结果：与PRV、HCV、PRRSV、JEV、SA215阳性血清呈阴性反应，而与PRV标准阳性血清呈阳性反应。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于猪伪狂犬病的临床诊断，尤其疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒截短GP5蛋白间接ELISA方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。     

鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%～90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白杆状病毒表达与间接ELISA方法建立

为了检测猪群中猪流行性腹泻(PED)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有PEDV N基因的重组杆状病毒r Bac-PEDV N并在昆虫细胞中获得表达。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了检测PEDV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。与Western Blot的符合率为91.3%,说明该方法适用于PED的临床诊断。     

非洲马瘟病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)的血清学诊断方法,本研究构建了非洲马瘟病毒VP7蛋白的原核表达质粒pET-32a-VP7,诱导表达后使用Ni-NTA对可溶性VP7蛋白亲和纯化,以重组VP7蛋白作为包被抗原,优化建立检测血清抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行敏感性、特异型和重复性验证,表明该方法的检测效果良好。本研究为非洲马瘟的血清检测试剂盒的开发提供的相关参考。     

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。     

A modified indirect immunofluorescent assay for the detection of antibody to Eperythrozoon ovis in sheep

Experimental ovine eperythrozoonosis was studied using Giemsa staining of blood films and a modified indirect immunofluorescent antibody assay (IFAA). The serums of 21 Border Leicester Merino cross lambs between 12 weeks and 7 months-of-age were analysed before and after infection with Eperythrozoon ovis (E. ovis) using the IFAA test. No rise in the IFAA titre was seen until day 7 and this coincided with the first detection of E. ovis organisms in blood smears stained with Giemsa. The percentage of E. ovis infected red blood cells peaked on day 14, but the IFAA titre did not peak until day 35. Titres to E. ovis, on average, had begun to drop by day 63. There was considerable individual variation in response to E. ovis infection as measured by the IFAA. Titres as high as 6,400 were observed in individual sheep at the peak of E. ovis parasitaemia of red cells. One sheep had a titre of 51,200 nineteen days after infection, and titres of 3,000 were maintained for several months in a few sheep. The assay proved reliable, and up to 100 samples per day could be tested. The antigenicity of the slide preparations was found to be satisfactory after storage for 6 months at -20 degrees C and 4 degrees C and for 28 months at -70 degrees C. Temperature fluctuations during storage rendered slides unsuitable for the IFAA after these times. A method of storing E. ovis infected blood in liquid nitrogen is described.     

基于猪丁型冠状病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年新发现的一种猪肠道病原体,主要感染仔猪并引起仔猪腹泻甚至死亡,针对该病建立快速、准确的血清学检测方法尤为重要.本研究以PDCoVHNZK-04毒株为模板扩增M基因并将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-32a-P...