BTV-16四结构蛋白的共表达与病毒样颗粒的制备

目前疫苗免疫是预防蓝舌病的主要有效手段,蓝舌病病毒样颗粒(VLPs)疫苗是蓝舌病疫苗研究的热点之一.为了制备蓝舌病病毒血清16型(BTV-16)病毒样颗粒,研究对载体pFastBac-Dual进行了改造,使其具有4个独立启动子的多克隆位点.依次将BTV-16 VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到改造后载体(pF4)...     

蓝舌病疫苗国内外研究进展

蓝舌病是反刍动物的一种非接触性传染病,主要发生于绵羊,在该病流行地区,于发病季节前接种蓝舌病疫苗可有效预防该病。总结了目前国内外蓝舌病弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒及重组疫苗的研究进展。以期为相关研究提供参考。     

QX型传染性支气管炎病毒病毒样颗粒的制备与初步评价

研究旨在制备一种针对QX型传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）的病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）疫苗并对其免疫保护效果进行初步评价。试验首先构建了分别表达QX型IBV S蛋白（QXLS）、M蛋白（QXLM）和E蛋白（QXLE）的三种重组杆状病毒rBacmid-QXLS、rBacmid-QXLM和rBacmid-QXLE,并通过间接免疫荧光试验（IFA）和Western blot鉴定目的蛋白的表达;进一步将3种重组杆状病毒通过适当比例共感染Sf9细胞获得VLP,经蔗糖密度梯度离心纯化后使用透射电子显微镜观察鉴定VLP的组装效果;最后将纯化的VLP与氢氧化铝佐剂混合制成疫苗免疫SPF鸡进行免疫保护效果评价。结果显示：S、M和E三种目的蛋白均能成功表达,透射电子显微镜观察可见组装形成的VLP呈现典型的椭圆形病毒样结构,直径为80～120 nm;单独VLP疫苗免疫具有一定的免疫保护效果,QXL87+VLP疫苗联合免疫保护效果较好,可有效减轻临床病变、降低气管和泄殖腔排毒量及组织器官载毒量。研究表明,试验已经成功制备出Q...     

云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5~10月,每周采血1次,11~12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性,至11月,监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2~13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚,收获鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。采用RT-PCR方法,针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物,扩增其相应片段。结果显示,共分离到86份疑似分离物,其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增,均扩增出1156 bp片段,初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验,67份毒株为蓝舌病病毒,与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现,BTV-1株序列与同型Y863(登录号:KC879616)参考毒株的同源性为92%,BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株,分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。     

蓝舌病病毒血清8型定性传入风险评估

2006年8月荷兰暴发的蓝舌病8型(BTV-8)疫情已蔓延至欧洲大陆,而国内目前尚未发现BTV-8感染的报道.为评估BTV-8传入国内的风险,采用定性评估方法,通过收集BTV-8疫源地国家的疫情信息数据,结合其病原学特征、传播媒介、分布及流行情况、传染源、传播途径和易感动物等方面的研究内容进行传入风险分析.鉴于我国与欧...     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

用纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得2株稳定分泌抗BTV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1F5和4E5).其细胞培养上清ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水ELISA效价分别为1:512 000和1:128 000.亚型鉴定表明,1F5和4E5分别为IgGl和IgG2a.ELISA结果显示,2株单克隆抗体仅与BTV反应,不与其他相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好.2株单克隆抗体1F5和4E5的相对亲和力指数分别为5.14×106mol/L和6.71×106mol/L.这2株单克隆抗体的获得为建立BTV免疫学检测方法奠定了基础.     

新疆蓝舌病病毒的分离及初步鉴定

针对新疆蓝舌病流行现状,本试验以蓝舌病血清学检测为阴性的动物建立监控群,于2014年5月至9月每周采集1次血样,血清学检测出现转阳动物后,取其转阳前后2周血样,接种10日龄鸡胚,收获死亡鸡胚肝脏,研磨浸毒后接种C6/36细胞和BHK-21细胞,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)样本进行PCR鉴定和电镜观察,并用细胞微量中和试验进行血清定型。经RT-PCR扩增蓝舌病血清型群特异VP7片段和NS1片段,鉴定在1 156,272,101bp处有特异性条带。电镜观察到疑似的病毒颗粒,中和试验结果显示该毒株为BTV-1型。上述结果显示,本研究分离到蓝舌病病毒1株,中和试验定型为BTV-1型。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒（FMDV）病毒样颗粒（VLPs）基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列（登录号：JN998085）,设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒（pFastBacDual）的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体（Bacmid）的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜（EM）进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1~VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25~30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展

综述了昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展,同时分析了昆虫杆状病毒表达系统表达流感病毒样颗粒用于流感疫苗的优势和前景,以期为兽用流感病毒VLPs疫苗研发提供参考。     

基因Ⅰ型乙型脑炎病毒病毒样颗粒的制备及其对小鼠的免疫原性分析

降低猪场的流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）感染率对于阻断人的JE暴发至关重要，鉴于我国JE防控形势的紧迫性和现有基因Ⅲ型商品化乙型脑炎病毒疫苗对部分基因Ⅰ型乙型脑炎病毒（genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus，GⅠ JEV）流行毒株免疫保护的不确定性，急需研制安全高效、成本低廉的新型猪用GI JEV疫苗。本研究在杆状病毒载体pFastBac^TM多克隆酶切位点插入GⅠ JEV的prME基因表达盒，测序验证后的阳性重组质粒转染DH10Bac^TM感受态细胞后获得Bacmid-prME重组杆粒，进一步将其转染至Sf9昆虫细胞后，获得Bac-prME重组杆状病毒。Western blot、间接免疫荧光及电镜观察GⅠ JEV病毒样颗粒组成蛋白表达及病毒样颗粒形成情况，通过小鼠免疫试验初步评价GⅠ JEV病毒样颗粒的免疫原性。Sf9昆虫细胞中prME基因表达盒编码的蛋白得到高效表达，且组装形成病毒样颗粒。病毒样颗粒免疫原性评估结果表明：GⅠ JEV病毒样颗粒可诱导免疫小鼠产生高滴度的乙型脑炎病毒中和抗体。本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了GⅠ JEV病毒样颗粒，为研制安全高效的乙型脑炎病毒病毒样颗粒亚单位疫苗提供物质基础。     

含组氨酸蛋白标签的蓝舌病假病毒物质构建及定量分析

基于蓝舌病（bluetongue,BT）的危害及RNA阳性质控品研制的重要性,试验将pTrcHis-MS2质粒借助点突变技术在噬菌体外壳蛋白15和16氨基酸之间插入组氨酸（His）蛋白标签,构建了pTrcMS载体。将pMD19-T-BTV质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切,然后连接构建pTrcMS-BTV重组质粒。将pTrcMS-BTV重组菌进行原核表达,产物借助偶联His蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的蓝舌病假病毒颗粒,进行特性鉴定并定量。结果显示,研制的pTrcMS-BTV物质经PCR方法评价纯度高,无基因DNA污染;透射电镜观察形态为不规则的直径约为26 nm的多边形;RT-PCR方法检测稳定性表明该物质耐RNase A,易保存;应用荧光RT-PCR检测表明该物质溶液最低检测限可达到2.5×10²拷贝/mL。蓝舌病假病毒物质将为蓝舌病分子生物学检测提供阳性质控物质。     

蓝舌病病毒分离株的定型研究

用国际标准蓝舌病病毒(BTV)型特异性血清和新制备的BTV型特异性血清,按OIE推荐方法进行蚀斑抑制试验,并试用“悬浮法”蚀斑抑制试验,对BTV分离株(L001)作了血清型鉴定,结果表明该分离株为BTV16型。与标准毒株相对照,两者试验结果完全一致;L001株的RNA的PAGE电泳带谱与BTV16型标准株的带谱相同。     

蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

Construction and Identification of Recombinant Avian Adeno-associated Virus Oviduct-specific Expressing Human Lysozyme Gene

In order to produce recombinant avian adeno-associated virus (rAAAV) oviduct-specific expressing human lysozyme (hLYZ) by the baculovirus expression system, one pair of primers was designed according to the published sequences for hLYZ, the hLYZ gene was amplified by PCR and cloned into baculovirus expression vector, which contained the oviduct-specific expression cassette and the inverted terminal repeats of avian adeno-associated virus (AAAV), the resulted plasmid was named as pFB-AIOVLYZ.Then the recombinant vector pFB-AIOVLYZ was transformed into E.coli DH10Bac, and the positive recombinant bacmid rBacmid-AIOVLYZ was screened according to the resistant and the blue-white plague screening,rBacmid-AIOVLYZ was transfected into the Sf9 insect cells by liposome. Once the cytopathic effect was found, the rBac-AIOVLYZ could be harvested.Sf9 insect cells cultured in suspension culture were infected with three recombinant baculoviruses, rBac-AIOVLYZ, rBac-VP and rBac-Rep, at an MOI of 5. 72 h later, Sf9 insect cells were collected, and recombinant viral particles rAAAV-OVLYZ were purified by filtration, chloroform extraction and PEG precipitation. Electron microscopy showed a typical morphologic feature of Parvoviridae family with virus particle size of about 20 nm. PCR results indicated that the target gene existed in the viral genome. The in vitro cell expression test showed that rAAAV could mediate the specific expression of hLYZ in oviduct cells. These results indicated that the rAAAV oviduct-specific expressing hLYZ was successfully prepared by baculovirus expression system, which laid the foundation for the preparation of hLYZ.     

输卵管特异表达人溶菌酶基因重组禽腺联病毒的构建及鉴定

试验旨在利用杆状病毒表达系统制备输卵管特异表达人溶菌酶（hLYZ）的重组禽腺联病毒（recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV）。参照已发表的hLYZ基因序列设计1对引物,PCR扩增hLYZ基因片段,亚克隆至含输卵管特异表达盒和禽腺联病毒（AAAV）两侧末端反向重复序列（inverted terminal repeat,ITR）的转移载体中,获得重组杆状病毒转移载体pFB-AIOVLYZ,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-AIOVLYZ,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-AIOVLYZ。将其与表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP及表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep以感染复数（multiplicity of infection,MOI）为5感染Sf9昆虫细胞,72 h后收集细胞沉淀,并经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀,即为rAAAV-OVLYZ。电镜结果显示,病毒粒子大小约为20 nm,形态结构与野生AAAV相似;PCR结果显示rAAAV含有目的基因;体外细胞表达试验说明rAAAV能介导hLYZ在输卵管细胞中的特异表达。结果表明,本研究利用杆状表达系统成功制备了输卵管特异表达hLYZ基因的rAAAV,为hLYZ的大量制备奠定了基础。     

利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因研究进展

杆状病毒表达系统是一种新型、高表达的真核表达系统,广泛应用在新疫苗、诊断试剂和新型蛋白药物开发研究方面。不少研究人员报道了利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因生产结构蛋白和非结构蛋白,期望表达的蛋白质具有与真实病毒蛋白相似的生物学活性,能够应用于候选疫苗或诊断检测抗原。作者对近几年利用重组杆状病毒表达口蹄疫结构蛋白基因和非结构蛋白基因的研究进展进行了综述,并提出相关问题和困难供商讨。