貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及生物学特性

为研究HtrA蛋白对貉源肠炎沙门菌毒力和生物学特性的影响,本试验利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等方面对突变菌株进行评价,结果显示:与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降,动物实验结果显示htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响，本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS)，并均经PCR及测序鉴定，结果显示，gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线，利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性；利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性；利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示，3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI)，分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力，并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示，WT与KO菌株的体外CI为0.32，表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示，相对于WT、RS菌株，KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<...     

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2，T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株，将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中，成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传，且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性，但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明，clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性，为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。     

鸡致病性大肠杆菌fimC基因缺失菌株的构建及生物学特性鉴定

本研究目的是研究fimC基因的功能。基于致病性大肠杆菌（APEC）Ⅰ型菌毛fimC基因的已知序列,通过PCR扩增了缺失169 bp的fimC基因片段,将其克隆到自杀载体pCVD442中,通过接合性转导将重组自杀性质粒pCVD442∷△fimC从大肠杆菌SM10λpir转到O2（Nal^R）中。根据同源重组原理构建了fimC基因缺失突变菌株O2（△fimC）。结合PCR扩增、测序结果及透射电镜观察,证明正确构建了fimC基因缺失突变株O2（△fimC）。体外生长及生化反应试验中,O2（△fimC）与亲本株存在一定差异。药敏试验中,两者无明显区别。鸡气管黏膜黏附试验及雏鸡的致病性试验表明：突变株在鸡气管黏膜上的黏附能力是亲本株的1/50,对雏鸡的致病性亦明显下降。鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimC基因缺失突变株的构建为深入探讨fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用、Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制及fimC基因缺失突变株其他生物学特性的研究奠定了物质基础。     

狐肺炎大肠杆菌ybjX基因缺失株构建及其对小鼠致病性检测

为研究外膜蛋白YbjX对大肠杆菌致病作用的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了狐肺炎大肠杆菌(HBCLE-12)ybjX基因缺失突变株(HBCLEΔybjX),并对其生物学特性进行分析,探索YbjX蛋白在大肠杆菌致病过程中的作用。结果表明,缺失株HBCLEΔybjX与野生型菌株和回补菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其运动能力和血清内存活能力显著下降,对多种抗生素的敏感性明显增强。动物试验表明,ybjX基因缺失突变株对小鼠的致病力显著下降。本研究为进一步阐释大肠杆菌致病机制和疫苗设计奠定基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)rpoE基因在Tibet-Pm1菌株中的部分生物学特性,试验利用同源重组技术筛选出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE,分析缺失株和原菌株Tibet-Pm1在外界环境生长、环境胁迫存活率、生物被膜形成、细胞黏附性和致病性上的差异。结果表明：利用同源重组技术成功构建出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE。缺失株的平均OD₅₉₅值为0.135,显著低于Tibet-Pm1菌株的平均OD₅₉₅值0.337(P<0.05)。在20℃条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株生长较缓慢,两种菌株的生长存在明显差异;不同温度下3 h内两种菌株生长的差异性较小。在紫外线照射条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由21.3%降到16.7%;在50℃高温条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由0.75%降到0.59%。在细胞黏附试验中,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株在MDBK中的黏附性由6.67×10⁵ ...     

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响，本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1 (WT) atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA (KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA (RS)，并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上，进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响，结果显示，在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异，但在M9培养基中生长明显减缓；KO菌株的部分生化特性也发生了变化，对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变，α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力，结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力，结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定，结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染...     

肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

狐肺炎大肠杆菌HtrA蛋白原核表达及多抗血清制备

利用PCR方法从银狐大肠杆菌基因组中克隆出htra基因,测序无误后将其构建到pET32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot方法验证重组蛋白得到很好表达;用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别大肠杆菌HtrA蛋白,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定基础。     

大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D缺失株,命名为BL21Δsly D;并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明,缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著,然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株(p0.01),表明大肠杆菌PPIases sly D基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌sly D基因缺失株BL21Δsly D为进一步研究大肠杆菌sly D基因的功能奠定了基础。     

猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌(O_(139))主要毒力基因SLT-Ⅱe A亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸,分别突变为谷氨酰胺(E1670)和亮氨酸(R170L)后,获得突变基因SLT-Ⅱe~*。通过同源重组,将野生菌中的毒力基因SLT-Ⅱe替换为SLT-Ⅱe~*,构建了一株毒力基因突变株(SLT-Ⅱe~*)。实验结果显示,该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1/500。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因缺陷型菌株的筛选

本研究以大肠杆菌(含有β半乳糖苷酶基因)为试验对象，用氮-甲基-氮硝基氮-亚硝基胍对其进行诱导突变，在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变，筛选到了β-半乳糖苷酶基因缺陷型的大肠杆菌受体菌株，从而为构建以β-半乳糖苷酶基因为选择标记的载体表达系统奠定了基础。     

粪肠球菌ace基因缺失突变株的构建

本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。     

大肠杆菌cpxR和hns双基因缺失株的构建

为构建调节蛋白H-NS及双组分信号转导系统CpxAR的单、双基因缺失株,本研究以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,以pKD4质粒为模板,分别扩增出含kan~r基因的线性打靶片段,在pKD46质粒的辅助及L-阿拉伯糖的诱导下进行Red同源重组,使线性打靶片段替换大肠杆菌ATCC25922中的cpxR、hns基因,再用pCP20质粒消除FRT位点间的kan~r基因,构建单基因缺失株△cpxR和△hns。接着以△cpxR为研究对象,用同样方法敲除hns基因,构建双基因缺失株△cpxR△hns。最后将重组表达质粒cpxR-pBAD/HisA、hns-pBAD/HisA电转入上述3种缺失株中,制备回补菌株△cpxR/pcpxR、△hns/phns、△cpxR△hns/pcpxR和△cpxR△hns/phns。结果表明,利用该重组系统成功敲除了大肠杆菌ATCC25922中cpxR、hns基因,构建了单、双基因缺失株△cpxR、△hns和△cpxR△hns以及它们的回补菌株,为研究H-NS及CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合作用的分子机制提供了有力的工具。     

肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。