EHP、SHIV双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明：该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green real-time PCR的10倍,普通PCR法的100倍;对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌,以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性;重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数小于4%,具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测,结果符合率为100%。本研究建立的EHP和SHIV检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对虾隐性感染的早期监测。     

虾肝肠胞虫实时荧光RAA快速检测方法的建立

为了早期快速诊断近些年流行于国内的虾肝肠胞虫,根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫EHP-SSU rDNA序列比对分析,在SSU基因内确定了一段156 bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物和探针,经过优化重组酶介导的核酸技术(Recombinase-aid-amplification,RAA)反应条件,建立快速检测虾肝肠胞虫的RAA恒温荧光检测方法。在RAA进行到24个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是10 copies/μL,相当于10个病毒粒子。利用该方法,从天然感染EHP的虾肝胰腺组织DNA中可以检测出片段,而健康的虾和感染了传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)和虾虹彩病毒(SIV)的组织则没有扩增条带。试验表明,本研究建立的RAA恒温荧光检测方法具有快速、成本低、特异性好、准确性高的特点,为大范围早期病害的快速检测提供了新方法。     

基于LAMP技术的对虾白斑综合征病毒现场快速高灵敏度检测试剂盒的评价

根据OIE《水生动物诊断手册》、农业部公告第683号和质检行业标准等规范性技术文件,为验证本实验室基于环介导恒温扩增技术(LAMP)研发的对虾白斑综合征病毒(WSSV)现场快速高灵敏度检测试剂盒的有效性,本研究对随机抽样的157套试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性等进行分析和评价。ASp结果显示该试剂盒与黄头病毒、偷死野田村病毒、肝胰腺细小病毒、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒6种对虾病原及对虾组织核酸均无交叉反应;ASe为102拷贝/μL;与OIE标准中WSSV的套式PCR方法相比,该试剂盒测试374份临床样品的DSp为95.8%,DSe为94.6%;该试剂盒对阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%,弱阳性样品的检测重复率为88.9%;该试剂盒可以在-20℃保存6个月以上。所研制的WSSV现场快速高灵敏检测试剂盒与OIE标准套式PCR方法检测结果符合率高。本研究结果表明该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好稳定性强等优点,能够满足实际应用中的WSSV高灵敏度检测需求。     

2015—2017年天津市虾肝肠胞虫流行情况调查

为了解天津市对虾肝肠胞虫（EHP）流行情况，2015—2017年从汉沽区、大港区、塘沽区、宁河区、静海区、津南区和西青区等7个对虾养殖主产区，采集养殖对虾及饵料生物等样品，应用PCR法进行EHP检测。检测结果显示：在2015—2017年分别检测的79、105、140批次样品中，EHP阳性率分别为56.96%、69.52%、29.28%；在凡纳滨对虾的仔虾、幼虾、中成虾养殖阶段均可检出EHP，但幼虾、中成虾的阳性率高于仔虾；鱿鱼、沙蚕和桡足类等对虾饵料生物携带有EHP。结果表明，天津市EHP流行率呈显著下降趋势，说明严格控制亲虾品质及引进无病毒感染种苗、加强检疫监测等措施，可以有效控制EHP流行。     

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明：建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10²～0.5×10⁶ copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。     

虾肝肠胞虫（EHP）流行病学与检测技术研究进展

近年来,虾肝肠胞虫(EHP)感染已成为对全球对虾养殖生产影响较严重的疾病之一。我国针对养殖对虾EHP感染的调查显示,该病具有较高的流行风险,是导致对虾生长缓慢的主要病原。为了解EHP的流行病学特点、检测方法和综合防治现状,结合国内外研究成果,对EHP基本特性、传播途径、致病性、检测技术和防控措施等方面的最新研究进行了综述,以期为EHP的预防和控制提供技术参考。     

虾肝肠胞虫Taqman荧光PCR方法的建立与应用

为给虾肝肠胞虫(EHP)的监测和控制工作提供特异、灵敏的快速检测方法,针对EHP 18S相关保守序列设计1对特异性引物,优化并建立EHP的Taqman荧光PCR检测方法,同时验证该方法的重复性和敏感性。结果显示:体系扩增的最佳退火温度为60℃,构建好的质粒标准品标准曲线斜率为-3.195,R2为0.991;扩增产物阈值循环数(Ct)与标准模板起始量(X)的关系曲线为-3.195×Log(X)+36.923,扩增效率为105.59。使用所构建方法检测湛江市EHP流行情况,同时对样品进行白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、桃拉综合征病毒(TSV)、早期死亡综合症(AHPND)病毒检测。结果显示:样品的WSSV、IHHNV、TSV检测均为阴性;AHPND检出阳性率为10%,EHP为30%,其中1份样品的EHP和AHPND检测同为阳性。本研究建立的EHP荧光PCR方法具有特异、灵敏等优点。该方法及其临床应用数据可为EHP的防控提供技术参考。     

弓形虫LAMP荧光检测方法的建立与应用

为建立一种弓形虫环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法，以弓形虫高度重复性保守序列为模板，设计合成2组引物，对引物组进行比对和反应条件优化，确定特异性与灵敏度。结果表明，建立的方法在62℃50 min内对弓形虫的检测灵敏度为1 copies/μL,灵敏度高于行业标准(NY/T 573—2022),且优于市售的实时荧光定量PCR检测试剂盒，与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体均无交叉反应。应用LAMP荧光方法检测已知背景信息的200份弓形虫临床样品，检出阳性样品10份，阴性样品190份，检测结果与标准方法、荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP方法具有快速、灵敏度高、特异性强、仪器设备适用范围广等优点，适于在兽医实验室及动物医院推广应用。     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

布氏杆菌S2疫苗株特有基因trbJ的LAMP检测方法建立

为了建立一种快速、准确地检测布氏杆菌S2疫苗株的环介导等温扩增(LAMP)方法,将S2基因组与牛种、羊种野毒株基因组比较,筛选出S2疫苗特有基因trbJ作为检测靶标序列,设计LAMP特异性引物,在对该反应组分、反应条件进行单因素优化的同时,还对该引物特异性、灵敏度、重复性进行测试。结果显示,该方法在65℃等温条件下扩增,反应结束后加入SYBR Green I荧光染料,即可通过肉眼直接观察结果。该方法灵敏性、特异性、重复性良好,能准确鉴别出S2疫苗,与对照菌株无交叉反应。与普通PCR技术相比,LAMP检测灵敏度高100倍,最低可检测出6.89 pg/μL的DNA模板,并且不同批次试剂间的重复性良好。本试验成功建立了一种快速、准确、可视化地检测S2疫苗的LAMP方法。