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相似文献
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1.
《中国兽医学报》2016,(5):739-745
选择新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因作为黑色素瘤的治疗基因。将小鼠端粒酶逆转录酶(mTERT)启动子、小鼠黑色素瘤酪氨酸酶(Tyr)特异性启动子核心片段以及HN基因分别插入到腺病毒载体穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2的多克隆位点处,将克隆成功的穿梭载体经Pme I线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,成功构建了肿瘤特异性和组织特异性双启动子调控的HN基因的重组腺病毒载体pAd-mTERTp-mTyrp-HN。将重组腺病毒通过脂质体法转染HEK 293细胞,经RT-PCR鉴定及Western-blotting对HN蛋白的表达水平分析后,大量扩增病毒,经CSCl密度梯度超速离心法纯化病毒颗粒,以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-TyrpHN和Ad-GFP的最终滴度分别为108.7、109.5、109.25、109.625和109.125,将为下一步利用该重组腺病毒在体内外诱导小鼠黑色素瘤细胞系B16的凋亡及研制动物肿瘤性疾病的基因疫苗提供了理论依据。  相似文献   

2.
《畜牧与兽医》2015,(11):1-5
为研究内溶素SAL-2和人溶菌酶h LYZ的联合抑菌作用,本研究通过PCR方法分别从携带SAL-2和h LYZ基因的质粒中扩增目的片段,连接至腺病毒穿梭载体的多克隆位点上,构建重组穿梭载体p Shuttle-SAL和p Shuttle-LYZ。成功构建的重组穿梭质粒与Ad-easy骨架质粒在BJ5183中发生同源重组,重组得到的阳性重组腺病毒载体在脂质体介导下转染HEK293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SALLYZ和对照重组腺病毒Ad-GFP,通过RT-PCR和Western blot方法检测mR NA和蛋白表达后,将构建的重组腺病毒进行扩增纯化并测定病毒滴度。结果表明,成功构建的重组腺病毒感染细胞后,SAL-2和h LYZ基因的mR NA均有表达,Western blot分别检测到28.6 ku和14.7 ku目的蛋白条带。扩增纯化后经TCID50方法检测病毒滴度分别为108.17TCID50/mL、108.50TCID50/mL、108.63TCID50/mL和107.60TCID50/mL。表明成功构建包装的重组腺病毒对HEK293细胞具有较强的感染能力,可稳定介导SAL-2基因和h LYZ基因在HEK293细胞中的表达。  相似文献   

3.
《中国兽医学报》2015,(12):1921-1927
为评价重组新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因植物乳杆菌对鼠结肠癌(CRC)潜在的抑制作用,试验以前期构建的可表达NDV HN基因的植物乳杆菌(简称重组菌HN/Lab)为研究对象,通过肿瘤诱导建立小鼠CRC皮下移植瘤模型,通过腹部手术建立小鼠原位移植瘤模型,并在肿瘤诱导前后给荷瘤鼠灌胃重组菌和不表达HN基因的植物乳杆菌(L.p),通过监测肿瘤体积、荷瘤鼠的存活率以及肿瘤组织的病理学来评价重组菌对CRC的抑制作用。结果表明,试验分别成功建立了小鼠CRC皮下移植瘤和原位移植瘤模型;重组菌(CT26+HN/Lab组)能明显抑制荷瘤鼠皮下肿瘤的生长,分别在肿瘤诱导后25,30 d差异显著(P0.05),重组菌组小鼠的存活率和生存时间也显著高于CT26组(P0.05);重组菌对小鼠原位移植瘤模型抑制效果明显,在肿瘤诱导7 d后即能明显抑制肿瘤的生长(P0.05),抑瘤率为43.13%,与植物乳杆菌(CT26+L.p组)23.03%抑瘤率相比有了明显的提高;病理组织学观察结果显示,重组菌诱导肿瘤坏死明显,浸润的淋巴细胞数量增多,能够抑制肿瘤细胞向黏膜层转移。因此,NDV HN基因重组乳酸菌对鼠CRC模型具有较好的抑制作用。  相似文献   

4.
《中国兽医学报》2015,(9):1483-1487
为了探讨旋毛虫A200711蛋白对BALB/c裸鼠皮下人肝癌H7402细胞实体瘤的抑制作用。本试验将BALB/c裸鼠右侧腋下注射人肝癌H7402细胞,建立裸鼠实体瘤模型。成瘤后,每2d向实体瘤中间部位多点注射0.2mL质量浓度为7.5mg/L的旋毛虫A200711蛋白,观察裸鼠一般临床症状及实体瘤生长情况;每3d称量裸鼠体质量,测量肿瘤直径,计算肿瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线;3周后处死裸鼠,小心剥离肿瘤组织,称量肿瘤的重量,计算抑瘤率。20d后裸鼠腋部皮下均长出肿瘤结节,成瘤率为100%,平均直径3~5 mm;与模型对照组比较,注射A200711蛋白12d后裸鼠实体瘤体积明显缩小,抑瘤率达到39.67%。结果表明,旋毛虫A200711蛋白对裸鼠人肝癌细胞实体瘤的生长具有明显的抑制作用。  相似文献   

5.
根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内.含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌.利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC).在Lipofectamine2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC).半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为10~(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础.  相似文献   

6.
研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。  相似文献   

7.
CAG和MLP启动子控制的重组禽腺病毒构建   总被引:1,自引:1,他引:0  
根据鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)的序列设计引物,通过PCR方法扩增了禽腺病毒FAVI-JS株的晚期启动子(MLP),序列与CELOV的MLP同源性为99%。分别构建了MLP和商品化启动子CAG控制的表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的禽腺病毒转移载体。通过载体与禽腺病毒FAVI-JS株在原代鸡胚肾细胞内进行同源重组,分别获得了MLP和CAG控制的表达eGFP的重组禽腺病毒,为探讨不同启动子对禽腺病毒活载体疫苗免疫效果的影响提供了条件。  相似文献   

8.
分析携TRAIL和HN基因的重组腺病毒在DT40细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应。通过RT-PCR分别从鸡外周血淋巴细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中扩增出TRAIL和HN基因,通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因的2A连接,将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-2A-HN,将质粒线性化后转染AD293细胞,包装后的重组腺病毒,经RT-PCR检测、荧光显微镜观察和病毒滴度测定后,将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况,采用流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长的影响以及Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-2A-HN对DT40细胞的凋亡作用。PacⅠ酶切证实同源重组成功;RT-PCR、荧光显微镜检测证实重组腺病毒质粒成功导入AD293细胞中且具有良好的感染性,滴度为1.9×1010PFU/mL;Western blot检测结果显示,TRAIL-linker-HN基因能够在DT40细胞中稳定表达并对DT40细胞产生细胞毒作用,且诱导细胞的凋亡率为29.52%,表明TRAIL-linker-HN具有双基因抑瘤的协同效应。  相似文献   

9.
[目的]旨在通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β亚基(Pyruvate dehydrogenase β subunit,PDHB)基因的重组腺病毒载体,为研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备。[方法]根据牛PDHB基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001035435)设计引物,克隆该基因的编码区(Coding Sequence, CDS)序列。测序验证后将其重组到穿梭载体pAdTrack-CMV上,经PmeⅠ线性化后,转化到含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的E. coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,以获得重组质粒pAd-PDHB。再将经PacⅠ酶切线性化的pAd-PDHB转染到HEK 293A细胞中,进行病毒包装并扩增高滴度病毒Ad-PDHB,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度。将高浓度的Ad-PDHB病毒感染牛肌内前体脂肪细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB的表达量。[结果]经测序验证,本实验克隆获得的牛PDHB基因CDS与数据库GenBank收录的序列一致。将PDHB基因CDS与穿梭载体pAdTrack-CMV重组并转染HEK 293A细胞后成功获得了重组腺病毒Ad-PDHB,其滴度为1.66×109 PFU.mL-1。腺病毒Ad-PDHB侵染牛肌内前体脂肪细胞后,PDHB在mRNA的表达水平比对照组高25.5倍。[结论]成功克隆了秦川牛PDHB基因并构建了重组腺病毒质粒pAd-PDHB,并获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因的高滴度重组腺病毒Ad-PDHB。  相似文献   

10.
本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。  相似文献   

11.
本研究应用女贞子多糖给小鼠饮水,探讨其对四氯化碳诱导肝损伤的保护作用。试验分为对照组、模型组、女贞子多糖高、中、低剂量组和阳性药组,通过检测各组小鼠的生长性能、肝脏指数、血清生化指标和丙二醛(MDA)的表达量,综合评估女贞子多糖的保肝作用。结果表明:与模型组相比较,饮水中添加不同剂量的女贞子多糖对小鼠生长性能无影响(P>0.05),但可以显著缓解四氯化碳所致的肝脏指数(P<0.05)、肝功能指标(P<0.05)和肝脏血清MDA含量(P<0.05)。饮水中添加女贞子多糖可以有效缓解小鼠化学性肝损伤,这可能与调节肝脏MDA的表达,抑制脂质过氧化反应有关。  相似文献   

12.
本研究建立克伦特罗间接竞争ELISA检测方法,对检测条件进行了优化确定,并利用猪尿液进行添加回收试验。结果显示:ELISA反应CLE-OVA包被抗原和CLE单抗的最适浓度分别为1:40 000和1:20 000,间接竞争ELISA的线性范围为0.016 l^8.520 0 ng/mL。该方法对克伦特罗、溴氯特罗、马布特罗和溴布特罗均有交叉反应。对冷冻储存半年以上的猪尿进行ELISA测定时,发现检测限可达58.848 3 ng/mL,药物添加回收率为85.19%~5 173.25%,变异系数为4.78%~96.79%;而经过MCX固相萃取柱净化处理后,检测限为0.076 ng/mL,添加回收率在101.21%~119.10%之间,变异系数为6.05%~18.38%。结果表明,SPE净化处理后,可有效去除尿液中的色素、蛋白等基质,提高了该法的灵敏度和准确性。  相似文献   

13.
为比较凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定饲料中粗蛋白质含量的准确性与检测效率,采用此两种方法同时对12个样品进行测定。结果表明:两种方法均能准确检测出样品中粗蛋白质含量,测定结果差异不显著(P>0.05)。凯氏定氮法检测效率较低,而杜马斯燃烧定氮法操作简易,检测效率较高,是值得推广的检测方法。  相似文献   

14.
调控毛囊发育的Wnt信号通路研究进展   总被引:1,自引:0,他引:1  
毛囊周期性发育过程受多种分子及信号通路调控,Wnt信号通路就是其中之一。Wnt信号通路调控动物发育过程中的多个重要环节,包括细胞增殖、细胞迁移及细胞分化等,且在毛囊发育过程中发挥着重要的调控作用,这对动物毛皮质量的提高、人皮肤损伤的治疗及日益严重的脱发问题等提供更多的研究思路和实际应用价值。近年来,Wnt信号通路已成为信号通路研究中的热点之一。因此,论文就Wnt信号通路、毛囊发育及Wnt信号通路对毛囊发育的调控作用进行了综述,为广大科研人员的后续研究提供参考。  相似文献   

15.
VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程度上促进蛋白的正确折叠,试验对不同物种来源的类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)进行比对研究。结果显示,获取到的3种鸡源SUMO蛋白与酵母源SUMO蛋白的氨基酸同源性均高于40%,其中SUMO-1与SUMO-3两种蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达;通过SUMO-1、SUMO-3与VP2蛋白的融合表达,证明了鸡源SUMO蛋白对VP2具有促溶效果,得到的重组菌株P-28A-s1-VP2和P-28A-Os3-VP2琼脂扩散效价均达到1∶16;经过纯化后,融合蛋白SUMO-1-VP2的琼脂扩散效价可达到1∶256;使用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明鸡源SUMO蛋白可以被成功切割,说明试验发现的鸡源SUMO蛋白可以作为促溶标签,在亚单位疫苗关键抗原表达中具有广阔的应用前景。  相似文献   

16.
为了研究甘氨酰-谷氨酰胺(Gly-Gln)和牛磺酸(Tau)对断奶仔猪血液抗氧化功能的影响,以28日龄杜长大断奶仔猪为研究对象,采用随机区组设计法将72头健康、体重相近仔猪分为4组,每组3个重复,每重复6头,公母各半,进行为期28 d的饲养试验。4个处理组分别为:基础日粮(对照组)、基础日粮+0. 25%甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln组)、基础日粮+0. 1%牛磺酸(Tau组)、基础日粮+0. 25%甘氨酰谷氨酰胺+0. 1%牛磺酸(复配组)。结果:Tau组中的血浆中超氧化歧化酶活性(SOD)显著高于对照组(P<0. 05);对于谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性,除Gly-Gln组在第7天显著高于对照组,第14、21及28天差异均不显著(P>0. 05)。对于还原型谷胱甘肽含量(GSH),在第14和21天Gly-Gln组极显著高于对照组(P<0. 01);对于血浆碱性磷酸酶活性(AKP),Gly-Gln组在第7和14天显著低于对照组(P<0. 05),第21和28天极显著低于对照组(P<0. 01)。研究表明:饲粮中分别或同时添加甘氨酰谷氨酰胺和牛磺酸有提高断奶仔猪血浆中的SOD、GSH-PX活性和GSH含量的趋势(P>0. 05),降低了血浆AKP活性(P<0. 05),从而提高了仔猪的抗氧化能力。  相似文献   

17.
本试验旨在研究不同质量苜蓿草粉对后备母猪生长性能、抗氧化及发情率的影响。试验选取120日龄(体重约40 kg)的后备母猪420头,随机分为4组(每组7个重复,每个重复15头猪)。对照组饲喂不含苜蓿草粉的基础饲粮,试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组分别饲喂添加10%低、中、高质量苜蓿草粉(粗蛋白质含量分别为15.1%、18.3%、20.0%;酸性洗涤纤维含量分别为40.3%、34.5%、28.8%;中性洗涤纤维含量分别为50.4%、41.7%、36.2%)的试验饲粮。预试期10 d,正试期100 d。结果表明:1) 120~220日龄阶段,试验组母猪平均日增重显著高于对照组(P<0.05),但试验组间差异不显著(P>0.05),试验Ⅰ组母猪平均日增重最高;试验组母猪料重比与对照组相比有降低趋势,但未达到显著水平(P>0.05)。试验Ⅲ组母猪的腹泻率和死亡率显著低于对照组和试验Ⅰ组(P<0.05)。2)与对照组相比,试验Ⅱ组、试验Ⅲ组母猪血清中甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。试验Ⅱ组和试验Ⅲ组母猪血清免疫球蛋白G和免疫球蛋白M含量均显著高于对照组(P<0.05)。试验Ⅱ组、试验Ⅲ组母猪血浆必需氨基酸中精氨酸、蛋氨酸、缬氨酸含量均显著高于对照组(P<0.05);母猪血浆非必需氨基酸中天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸含量显著高于对照组(P<0.05)。3)试验Ⅲ组与对照组相比母猪190~220日龄的发情率显著提高(P<0.05),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组母猪血清雌激素含量显著高于对照组(P<0.05),试验Ⅲ组母猪血清瘦素含量显著高于对照组(P<0.05),试验组母猪血清孕酮含量与对照组的差异没有达到显著水平(P>0.05)。4)与对照组相比,试验Ⅱ组与试验Ⅲ组母猪血清丙二醛含量显著降低(P<0.05)。试验Ⅲ组母猪血清超氧化物歧化酶活性显著高于对照组(P<0.05)。综合分析得出,在后备母猪饲粮中添加10%中质量(粗蛋白质含量为18.3%)和高质量(粗蛋白质含量为20.0%)苜蓿草粉具有更好的生产效果,添加10%中质量(粗蛋白质含量为18.3%)苜蓿草粉具有更好的经济效益。  相似文献   

18.
以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒中和试验检测结果相比较。结果显示,该方法可特异性检测EBOV抗体,与马尔堡病毒、裂谷热病毒等的阳性血清均不发生反应;与假病毒中和试验测得的抗体效价增长规律相一致。结果表明,本试验成功建立了EBOV抗体间接血凝检测方法,该方法安全、简便、快捷,为EBOV疫苗免疫后的效果评价提供了又一新的检测方法。  相似文献   

19.
采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。  相似文献   

20.
文章旨在评估酵母培养物对饲喂毒素污染日粮断奶猪生长性能、器官健康和免疫状态的影响。试验选择体重为(8.75±0.38)kg,28 d断奶的三元杂交猪500头,随机分为5组,每组5个重复(20头/重复),试验共开展42 d。对照组为未加毒素污染原料,处理1组含150μg/kg黄曲霉B1毒素+1100μg/kg呕吐毒素,处理2组在处理1组中添加2 mg/kg蒙脱石,处理3组在处理1组中添加1.0 mg/kg蒙脱石和0.5 mg/kg酵母培养物复合物,处理4组在处理1组中添加0.5 mg/kg蒙脱石和0.5 mg/kg酵母培养物复合物。结果显示:日粮污染降低了仔猪日增重,通过增加单核细胞和免疫球蛋白来改变免疫系统。霉菌毒素可引起肝、胆管增生和核肿大等组织损伤。毒素污染日粮添加2 mg/kg蒙脱石或1.0 mg/kg蒙脱石和0.5 mg/kg酵母培养物复合物降低了霉菌毒素对免疫系统和肝脏的影响,改善了仔猪生长性能。结论:日粮添加2 mg/kg蒙脱石或1.0 mg/kg蒙脱石和0.5 mg/kg酵母培养物复合物对饲喂毒素污染日粮猪的健康和生长性能具有改善作用。  相似文献   

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