牛分枝杆菌mpb51-63融合基因的克隆及其原核表达

为提高牛分枝杆菌(M.bovis)单一抗原的抗原性,本研究以重叠延伸拼接PCR技术将M.bovis mpb51与mpb63基因连接,并克隆至pMD18-T中,构建重组质粒pMD-51-63。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-51-63和pET28a(+),将纯化的mpb51-63融合基因亚克隆至pET28a(+)中,获得了重组表达质粒pET-51-63。该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达约46 ku的外源融合蛋白,免疫印迹实验证实,该融合蛋白具有M.bovis的抗原反应性。为进一步研究mpb51-63融合基因及其表达产物作为牛结核病亚单位疫苗、核酸疫苗以及特异的诊断试剂奠定了基础。     

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat6融合基因的分子克隆及表达

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a（＋）中获得重组质粒pET64-85b-e6。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1 mmol/L）进行诱导,SDS-PAGE电泳分析表达情况,以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western blot分析融合蛋白的免疫活性。结果表明：表达的融合蛋白大约为76 Ku,与预测大小相符,以Ni^2＋亲和层析柱纯化的融合蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT-6的融合表达及重组蛋白的初步应用

应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因mpb70-mpb83后,将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a( )中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni2 亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法,并检测了117份临床血清样本(其中67份为PPD阳性牛血清),阳性率为39.32%(46/117)份,与PPD皮试诊断的符合率为82.05%(96/117)。     

牛结核分枝杆菌重组多抗原表位基因的原核表达与鉴定

利用DNAStar对牛结核分枝杆菌的3个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位经全基因合成后,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到相对分子质量约为21 000的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后进行Western-blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分枝杆菌的多克隆抗体识别,表明该蛋白具有良好的反应原性。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.     

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT-的融合表达及重组蛋白的初步应用

应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlap extension，SOE）获得融合基因mpb70-mpb83后，将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a（＋）中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni^2＋亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法，并检测了117份临床血清样本（其中67份为PPD阳性牛血清），阳性率为39．32％（46／117）份，与PPD皮试诊断的符合率为82．05％（96／117）。     

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%（17/18）。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。     

牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

牛分支杆菌MPB70和CFP10-ESAT6基因的表达与检测

以牛分支杆菌染色体DNA为模板,分别以MPB70、CFP10-ESAT6融合蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入PQE30质粒,构建出原核表达载体PQE30-MPB70,PQE30-CFP10-ESAT6.将质粒转化至感受态DH5α中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外源蛋白带.纯化蛋白后作为包被抗原建立ELISA方法,为进一步研究牛结核病诊断方法奠定基础.     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

基因免疫制备牛分枝杆菌MPB64抗原单克隆抗体

为了建立针对牛分枝杆菌分泌抗原MPB64的检测手段,制备该抗原的单克隆抗体,构建真核表达载体pcDNA-mpb64,以原核表达并纯化的融合蛋白H-MPB64包被ELISA板,建立单克隆抗体检测方法。利用基因免疫方法免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出针对牛分枝杆菌分泌蛋白MPB64的单克隆抗体一株,并制备了腹水,经鉴定腹水效价达到1∶10240,采用硫酸铵沉淀法纯化腹水,纯化抗体效价为1∶8000,为今后研制分枝杆菌鉴定技术奠定基础。     

间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用

针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。     

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。     

Tuberculosis in domesticated red deer: Comparison of purified protein derivative and the specific protein MPB70 for in vitro diagnosis

The use of a Mycobacterium bovis-specific protein, mycobacterial protein bovis 70 (MPB70), was compared with complex, M bovis-derived purified protein derivative (bovine PPD), for its ability to improve the diagnostic precision of in vitro assays for tuberculosis in farmed deer. A combination of lymphocyte transformation and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to differentiate between specific M bovis reactivity and crossreactivity due to sensitisation with saprophytic mycobacteria such as Mycobacterium avium. In the lymphocyte transformation assay the response of mononuclear cells, from red deer, to MPB70 was found to be more specific, but less sensitive, as an indicator of infection by M bovis when compared with the complex antigen bovine PPD. When used in conjunction with bovine PPD alone, MPB70 was found to increase the specificity of the ELISA in diagnosing animals with disease.     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

Cell mediated and humoral immune responses of white-tailed deer experimentally infected with Mycobacterium bovis

The objective of this study was to improve the understanding of immune responses of whitetailed deer (Odocoileus virginianus) infected with Mycobacterium bovis. Ten mature, female, white-tailed deer were inoculated by intratonsilar instillation of 2 x 10(3)or 2 x 10(5)colony-forming units of M. bovis. Lymphocyte proliferation and humoral response to M. bovis PPD and the M. bovis protein, MPB70 were measured. Deer were tested for exposure to M. bovis by the comparative cervical skin test. Biopsy specimens of skin test sites were examined microscopically and immunohistochemically. The comparative cervical skin test correctly identified all M. bovis -inoculated deer as exposed to M. bovis. Lymphocyte proliferative responses to MPB70 were more consistent than responses to M. bovisPPD in M. bovis -inoculated deer. Antibody responses were more prominent in deer with disseminated disease than in deer with localised disease. The cellular components of delayed-type hypersensitivity reactions at skin test sites were similar to tuberculin reactions in other species. T lymphocytes of the gamma/delta phenotype were seen in increased numbers in M. bovisPPD injection sites.     

牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测

为了制备牛分枝杆菌的单克隆抗体,本试验利用制备的原核表达的牛分枝杆菌重要抗原蛋白MPB70作为免疫原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术,经过5次亚克隆与筛选,取已免疫好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3500的作用下进行细胞融合。筛选得到了2株分泌抗牛分枝杆菌MPB70蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为Anti-B-MPB70：8和Anti-B-MPB70：12。采用间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行亲和常数检测、效价分析及亚类鉴定,通过SDS-PAGE凝胶试验对单克隆抗体进行纯度分析,并检测其浓度,通过Western blotting方法对单克隆抗体的反应特性进行鉴定。结果显示,纯化后的MPB70蛋白分子质量大小为20 ku,浓度为0.5 mg/mL。两株单克隆抗体的亲和常数分别为9.95×10⁹和9.53×10⁸;抗体效价分别为1∶102 400和1∶12 800;抗体亚类分别为IgG_2b和IgG₁,轻链类型均为κ型;纯度>90%;浓度分别为3.0和2.2 mg/mL;且具有良好的反应特性。以上研究结果表明,本试验成功制备了抗MPB70蛋白单克隆抗体,可为牛结核病病原和抗体检测技术研究奠定基础。