猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

猪圆环病毒2型核酸载体构建及分子免疫研究

利用PCR技术和亚克隆技术构建了猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白基因与猪a—IFN基因的真核双表达质粒pIRES—Cap—α—IFN,经酶切、PCR鉴定和测序表明构建成功。将该质粒免疫6～8周龄BALB／c纯系小鼠,每隔2周免疫1次,共免2次,每次免疫前采血分离血清,实验结束时杀鼠取脾制备T淋巴细胞。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体水平,用MTT法检测T细胞增殖情况。结果表明,pIRES-Cap—α—IFN免疫组能显著刺激T淋巴细胞增殖（P〈0．05）,促进机体产生体液免疫但差异不显著（P〉0．05）,为PCV2核酸疫苗研究奠定了较好的前期基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组耐热新城疫病毒的构建及免疫原性

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,给全球养猪业造成了巨大的经济损失.为研发新型PCV2疫苗,采用反向遗传操作技术,以耐热低毒的新城疫病毒TS09-C株为载体,将PCV2主要免疫原蛋白Cap以单独编码框的方式插入至TS09-C株的基因P和M之间,为增强Cap蛋白在载体内的高效...     

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果：将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白（Rep）和核衣壳蛋白（Cap）,其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV）,与腺病毒骨架载体（pAdEasyTM）共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒tAd-Cap,测定其TCID50为1015．7／mL。用RT—PCR、间接ELISA、Westernbfot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的研制及其应用

以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:10⁵。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白杆状病毒载体表达及免疫保护性分析

为了获得低成本高产量的抗原表达,开发新型、有效防控猪圆环病毒的亚单位疫苗,根据猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白序列,通过软件设计优化了密码子并合成cap基因,利用多角体病毒作为载体,构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组病毒,命名为flashBAC-PCV2-ORF2株.经过鉴定,证明该病毒株表达Cap蛋白的抗原量在...     

猪圆环病毒2型Rep蛋白在真核细胞中的表达与定位

为了构建Rep蛋白真核表达质粒，研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因，并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示，重组的pEGFP—PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP—PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h，PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达

根据PCV2Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因（702bp）。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体（pAdeasy-1）共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Westernblot检测证明PCV2Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。     

表达猪圆环病毒2型CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒的构建

为了构建共表达猪圆环病毒2型(PCV2)CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒,本研究将CAP基因和猪IL-18基因分别置于pSY538的痘病毒启动子LP2EP2下,然后插入到含有痘苗病毒启动子P11启动的LacZ基因的禽痘病毒转移载体pSY681/lacZ中,获得重组转移质粒pSY681/CAP/IL18。将重组质粒pSY681/CAP/IL18转染入鸡胚成纤维细胞内,使CAP基因、猪IL-18基因和LacZ基因同源重组到禽痘病毒S-FPV-017中,产生重组禽痘病毒,经多次蓝斑克隆筛选纯化后,最终得到共表达CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-CAP/IL18)。以rFPVCAP/IL18感染CEF,通过RT-PCR检测,CEF细胞中含CAP基因和猪IL-18基因的mRNA,间接免疫荧光试验证实感染rFPV-CAP/IL18的CEF能表达CAP蛋白。重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的CAP和猪IL-18,为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中.经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV.重组穿梭质粒用Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒.将构建的重组腺病毒按照每100μL 1×107蚀宽单位(PFU)滴鼻2次免疫6～8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清.用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究.     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型重组多肽抗原的免疫保护效果

为检验猪圆环病毒2型(PCV-2)重组多肽抗原对猪的免疫保护效果,以表达的重组大分子多肽作为抗原,断奶仔猪为实验动物,设置多肽疫苗组、常规市售Cap蛋白亚单位疫苗组和不同对照组进行免疫。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清特异抗体(IgG),当抗体达到一定水平时进行攻毒试验,对试验各组的临床症状、体征变化及病毒血症进行观察和动态检测,对PCV-2易感组织进行病毒检测及组织病理学检查,最终评估该多肽疫苗的免疫效果及保护率。结果显示:表达的多肽疫苗能够快速产生体液免疫应答,具有显著的免疫效果;攻毒后采集的各项试验数据也表明该多肽疫苗的免疫保护效果理想。     

两株猪圆环病毒2型的分离鉴定和小鼠致病性试验

采集自江苏某猪场临床表现为疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪组织病料,经PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性,阳性病料经无菌处理后接种PK-15细胞进行PCV2分离并进行测序。采用间接免疫荧光(IFA)和相关基因序列分析软件进行鉴定、分析。用分离的毒株人工感染BALB/c小鼠,观察其对小鼠的致病性。结果显示,成功分离到2株PCV2毒株,分别命名为X46和5123,两毒株基因全长均为1 767 bp,遗传进化和同源性分析显示两毒株分别为PCV2d和PCV2b亚型,分离株P20代毒在PK15细胞上的TCID_(50)分别为10~(5.5)TCID_(50)/0.1 mL和10~(4.5)TCID_(50)/0.1 mL。小鼠感染试验结果显示PCV2对小鼠增重有抑制作用,对肝、脾和肾有较强的侵袭能力。研究结果为深入研究PCV2的致病机理及开发新型疫苗奠定了一定的基础。     

VP22短肽融合猪圆环病毒2型重组病毒样颗粒的构建及其鉴定

采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

House fly vector for porcine circovirus 2b on commercial pig farms

We investigated the on-farm potential of common farm invertebrates to transmit porcine circovirus genotype 2 (PCV2) and other non-enveloped viruses. In 2007 (pre-PCV2 vaccination) and 2008 (post-PCV2 vaccination), invertebrate communities were trap-collected (8 trap-dates per year), counted and sorted into genus and species groups on 5 farm study sites within England. Total DNA was extracted from feces of representational cross-sections of pigs on each farm in each year and also from intact samples of Diptera flies (ca. 20 flies per trap) and dissected viscera of any cockroaches (ca. 5 per trap). Each DNA sample was tested for the presence of PCV2 DNA by separate PCRs for ORF1 and ORF2. Positive samples were sub-typed via DNA sequencing of PCR products. The pig-associated Diptera fly community was dominated by Musca domestica (house fly) in both years on all 5 farms; numerous Blatta orientalis cockroaches were only noted on 1 farm throughout. Specific PCV2b DNA elements were routinely detected (25-60% of samples) in weaner/nursery pig feces in 2007, but not in other age groups. Musca collected on 4 of the 5 farms in 2007 was also positive for PCV2b DNA elements. Comparison of ORF2 sequences indicated that ORF2 sequences indicating PCV2b genotype were identical in pigs and flies. Minor changes were noted in ORF1 sequences from different samples. Flies collected in the weaner/nursery area were most likely to be positive (22-50% of fly-trap samples). DNA extracted from all cockroaches (2007 and 2008) and all flies and pig feces in 2008 were also negative throughout. We suggest that Musca flies have the most likely on-farm potential to carry and transmit PCV2b due to their life cycle incorporating stages in close association with pigs and their habitat. Vaccination appeared to reduce environmental load of PCV2b.