非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。     

猪弓形虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪弓形虫检测方法,根据弓形虫保守基因序列,设计一套特异性引物和FAM荧光素标记的MGB探针;通过对PCR反应体系和反应条件进行优化筛选,建立了猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法,并对此PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对60份疑似弓形虫感染的临床样品进行了检测。结果显示:建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法在101～107拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对弓形虫重组阳性质粒出现阳性扩增信号,但对阴性对照的水和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自60份疑似猪弓形虫感染样品中检出32份阳性,并且和克隆测序结果一致。结果表明,本研究建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法可用于猪弓形虫的快速检测,从而为猪弓形虫病的诊断提供了特异、敏感、高通量的方法。     

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测.     

检测伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR方法的建立

利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒（PRV）各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种快速检测伪狂犬病病毒的荧光定量PCR技术。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对制备的pMD-gB阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/反应;同时相比于普通PCR方法其灵敏度高100～1 000倍以上,并且重复性好。在对60份临床样品的检测中,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。     

犬细环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。     

火鸡疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究针对火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)FC-126毒株sorf1基因序列,设计特异性的扩增引物和探针,建立了检测HVT的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的荧光定量PCR方法灵敏度高,最低可检测到1×10~2 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;对鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鹅细小病毒、4型禽腺病毒和8型禽腺病毒均无特异性扩增,具有较好的特异性;组间和组内变异系数均小于1%,表明该方法重复性好。用建立的荧光定量PCR方法对82份HVT样品进行检测,结果43份为阳性,普通PCR只检测出30份阳性样品。结果表明本研究建立的HVT TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重要性好,为监测HVT的病毒含量提供了一种有效的手段。     

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)进行准确定量检测，针对BRSV F基因设计特异性引物，构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒，以其为模板优化反应条件及反应体系，建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示，针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好，相关系数为0.995 2;灵敏度高，BRSV最低检测限达3.9×10¹ copies/μL;特异性良好，可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性；重复性好，批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测，荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

鸽圆环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Rep保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1.43×10²~1.43×10⁸copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.998;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1.43×10²copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的1000倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于0.8%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床鸽血清样品检测结果显示,PiCV阳性率达38.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(28.7%),说明该方法具有良好的适用性。研究结果PiCV的流行病学调查、病原学监测及定量研究奠定了基础。     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

犬细小病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中CPV VP2蛋白基因序列,选择CPV VP2基因保守序列,分别设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了CPV Taq Man荧光定量PCR检测方法。对CPV Taq Man荧光定量PCR的反应体系和反应条件进行优化,并对其特异性和敏感性进行了测定,建立标准曲线。结果,CPV Taq Man荧光定量PCR对CPV检测阳性,并能对10拷贝/μL的CPV模板检测阳性,标准曲线的相关系数为0.9992,但对非CPV模板检测阴性。结果表明,所建立的CPV Taq Man荧光定量PCR具有很好的特异性和敏感性,标准曲线具有很强的实用性。同时对CPV Taq Man荧光定量PCR与CPV PCR进行了比较试验,结果前者比后者的敏感性高100倍。采用CPVHA、CPV PCR与CPV Taq Man荧光定量PCR对55份临床样品进行检测,CPV HA对30份样品检测阳性,CPVPCR对40份样品检测阳性,CPV Taq Man荧光定量PCR对47份样品检测阳性。这表明,CPV Taq Man荧光定量PCR对样品的检出率最高,具有特异、敏感、快速的特点,适用临床样品的检测。     

猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用

为快速诊断和检测猪链球菌病,根据GenBank中已登录的猪链球菌抗原基因保守区域序列,设计并合成特异性引物及Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应体系及扩增条件,构建了快速、准确检测猪链球菌的Taqman荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR),测定了该方法的灵敏性、重复性和特异性,并对疑似猪链球菌临床感染样本进行了检测。结果显示:所建立的Taqman FQ-PCR方法检测灵敏度为1×10~2拷贝/μL;对3种不同浓度的猪链球菌重组质粒进行3次重复扩增,变异系数均小于3%,说明重复性好;特异性检测显示,只有猪链球菌样本的扩增曲线呈阳性反应,其他致病菌均无荧光信号;采用此方法,对30份临床疑似猪链球菌感染样本进行检测,发现有27份样本为阳性,比采用国标法检测得到的结果更加灵敏。结果表明,建立的FQPCR方法具有灵敏性高、重复性好、特异性强等特点,可用于猪链球菌的快速诊断和检测。     

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测.结果显示具有良好的重复性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%.但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍.     

盖塔病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测盖塔病毒(Getah virus,GETV)的核酸,并初步应用于GETV的临床标本检测。根据GenBank登录的GETV全基因组序列,应用生物学软件进行序列比对,在NSP1保守区设计1对特异性引物和TaqMan探针。建立实时荧光定量RT-PCR检测GETV的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法能特异性地鉴别检测GETV;检测灵敏度高,检测的最低模板量可以达到2.03×10~1 copies/μL;将收集到的10 000只蚊子样品分成100份进行检测,共检测出8份GETV阳性样品,与常规反转录PCR(RT-PCR)检测及病毒分离结果吻合。本研究建立的GETV TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于GETV的临床早期诊断。     

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。     

猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用

为了灵敏而便捷的检测猪圆环病毒3型(PCV3),根据PCV3ORF2基因组保守序列设计合成4对引物,先使用荧光染料(SYBR)定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段,并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针,通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品,并且对1.29×10~2~1.29×10~9拷贝·μL~(-1)的PCV3标准质粒(Pmd18-t-Cap)呈现良好的线性关系,该方法的检测灵敏度为1.29×10~2拷贝·μL~(-1),比常规PCR的灵敏度高100倍,该方法与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应,具有良好的特异性;批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数(CV)均小于1.5%,呈良好的可重复性。用该方法对2016年至2017年间收集的124份来自湖北省等地的猪病料DNA样品进行检测,结果显示本地区PCV3阳性率为8.06%(10/124),PCV2和PCV3共感染率为8.06%(10/124)。上述结果表明,本研究建立TaqMan荧光定量PCR能够灵敏特异的检测圆环病毒3型,为圆环病毒3型的临床检测提供有效手段。     

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感、特异的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法,根据Gen Bank登录的HPS 16S rRNA基因序列,设计1对特异性引物和1条特异性Taq Man-MGB探针,建立了HPS荧光定量PCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性以及重复性和稳定性进行了验证。结果显示:本研究建立的HPS FQ-PCR方法在10~1~10~6拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系,所得相关系数为0.998;检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;特异性好,对pGEM-T/HPS重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对4个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/HPS重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好。对30份临床疑似HPS感染的组织样品进行应用检测,检出19份阳性,比商品化的HPS FQ-PCR检测试剂盒及常规PCR方法的阳性检出率高。结果表明,本研究建立的HPS FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的优点,可用于临床HPS感染猪的早期检测,对HPS的快速诊断、综合防控具有重要意义。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。