基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因

旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示：在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM3138、STM3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM3138、STM3031、ttrB、hilD、pstS、STM1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。     

敲除小RNA gcvB后沙门菌的转录组分析

为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。     

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示：成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调（P<0.01）,具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调（P<0.01）,具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活...     

伴侣蛋白Hfq对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究小RNA(sRNA)伴侣蛋白Hfq在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染致病过程中的作用,本研究采用Red同源重组法构建了禽致病性大肠杆菌FY26的hfq缺失株FY26Δhfq,通过测定缺失株生长曲线、生物被膜形成、体内定殖、胞内存活等能力来判定sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的影响。在体外,生物被膜形成能力直接决定着细菌对外界环境的抵抗能力,而在细菌进入体内后,其生长速率、黏附、定殖、吞噬细胞内的存活等能力均会直接影响其致病力。在进行了缺失株FY26Δhfq与野生株FY26的生长曲线测定试验、生物被膜形成能力测定试验、感染雏鸡试验、雏鸡体内定殖与侵袭试验、DF-1细胞黏附及HD11吞噬细胞内存活试验后,结果表明：hfq缺失株相较野生株其生长速率下降,生物背膜形成能力降低了18.6%,感染雏鸡时毒力降低,感染7 d后存活率为80%,在雏鸡体内定殖侵袭减弱,体内竞争能力下降至33.2%,对DF-1细胞的黏附能力降低,HD11吞噬细胞内的存活能力下降,单个细胞内存活的细菌数大多少于6个。研究表明,sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC的致病力起着关键的正向调控作用。     

布鲁菌Hfq蛋白研究进展

布鲁菌病(布病)是一种严重的人兽共患病。作为布病的病原,布鲁菌能够耐受宿主体内的各种杀菌机制并持续的生存。当布鲁菌侵入宿主体内后,必须适应抗体免疫的环境,而这依赖于布鲁菌对自身基因表达的巧妙调控。Hfq蛋白是一个RNA伴侣分子,对于介导sRNA的转录后调控发挥着重要的作用。在多种细菌中,对Hfq蛋白的功能都进行了深入的研究,目前已经发现该蛋白与细菌基因的表达调控、细菌对多种应激环境的适应能力以及致病菌的毒力均有着密切的关系。论文对Hfq蛋白的结构,对sRNA的调控功能,特别是布鲁菌Hfq蛋白调控功能的研究现状及在布病疫苗研发中的应用进行系统的介绍,为布鲁菌基因的表达调控和布病防控技术的研究提供参考。     

鼠伤寒沙门菌ATCC13311诱导耐药株的转录组测序和分析

为研究鼠伤寒沙门菌ATCC13311和其诱导耐药株在转录组水平上的差异,使用环丙沙星为诱导药物,采用梯度浓度诱导法,诱导鼠伤寒沙门菌ATCC13311产生耐药性。构建ATCC13311和其诱导耐药株TW4的转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq双向测序及数据分析。诱导获得ATCC13311对环丙沙星MIC值为4mg/L的耐药菌TW4。测序获得了4.46G有效数据,通过de novo拼接,获得了311条unigene,平均长度为15 587bp。拼接所得到的全序列长度为4 847 532bp,经预测4 998条基因中有4 902条得到GO注释。采用COG功能将注释基因划分为25类。初步确定TW4有3 434个基因表达量显著上升,32个基因表达量显著下降,7条代谢途径表达差异显著。利用转录组测序技术对鼠伤寒沙门菌ATCC13311和其诱导耐药株TW4进行研究,揭示了鼠伤寒沙门菌耐药性诱导前后差异表达的基因和显著变化的代谢途径,为深入研究细菌耐药分子机制及与细菌代谢途径之间的联系提供重要依据。     

沙门菌中GcvB sRNA可调控aphA mRNA

aphA编码B类酸性磷酸酶,本研究旨在将沙门菌中phA以lacZ进行替换,获得△aphA∷lacZ,从而了解GcvB sRNA对aphA mRNA的调控作用.通过使用λ red同源重组、FLP/FRT重组系统、电转导等技术构建相应缺失菌株,并进行β-半乳糖核苷酸酶活实验与qPCR鉴定相应表达量变化.在qPCR实验中,相...     

沙门菌非编码小RNA调控功能研究进展

细菌非编码小RNA（sRNA）是原核生物中新发现的基因表达调控因子,可在转录后水平调节基因的表达。沙门菌是sRNA研究的模式菌,研究者利用生物信息学预测技术、全基因组分析技术和高通量RNA测序技术,至少发现70余种沙门菌sRNA。它们通过感应温度,pH值,渗透压或氧分压等环境信号,利用碱基互补方式与靶标mRNA结合,调控靶标mRNA的翻译、降解或稳定性。通常一种sRNA有多个靶基因或靶位点,可调节多种基因的表达,在沙门菌营养物质代谢、外膜蛋白合成、群体感应和毒力表达等诸多生命过程中发挥重要的调控作用。     

鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB靶基因的预测与验证

为筛选鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB调控的靶基因,本研究通过TargetRNA2软件预测能与GcvB R1、R2和R3区产生作用的基因,将鼠伤寒沙门菌gcvB基因敲除株的转录组测序结果注释到KEGG数据库以及GO富集分析,并利用荧光定量PCR对预测的靶基因进行验证。TargetRNA2的预测结果显示,杂交能量最高的narY、yeaK、trpB和STM2732基因均能够和小RNA GcvB产生至少7个连续的碱基互补,narY、yeaK和trpB基因分别与鼠伤寒沙门菌无氧呼吸、脯氨酸与tRNA的识别以及色氨酸的合成相关。荧光定量PCR检测结果显示,narY、yeaK、trpB和STM2732基因在gcvB基因敲除条件下转录水平分别上调3.4、9.8、12.1和18.37倍。以上结果表明,narY、yeaK、trpB和STM2732基因受小RNA GcvB的负调控且可能为直接负调控。本研究为进一步探明小RNA GcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制以及沙门菌致病机制奠定了基础。     

肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为探究肠炎沙门菌伴侣蛋白Hfq对nmpC的调控机理及其基因编码产物OmpD在致病过程中参与的生物学功能,采用PCR方法扩增肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD基因nmpC,并将其克隆至原核表达载体pColdTM TF,构建重组表达载体pColdTM TF-nmpC.将其转化受体菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白OmpD.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得鼠源抗OmpD抗体.结果显示,经酶切、测序和Western blot鉴定分析,本研究成功构建并表达肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD,经纯化后免疫BALB/c小鼠,获得特异性的鼠源OmpD多克隆抗体,为进一步探究肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD在致病过程中参与的生物学功能奠定基础.     

沙门氏菌LAMP可视化检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速现场检测,根据沙门氏菌invA基因编码区序列,设计合成1套引物,通过对反应物浓度和反应条件优化,建立了沙门氏菌属特异性LAMP检测方法;通过对invA基因8个区域的6条引物配对进行等温扩增,并在反应体系中加入HNB来指示反应结果,实现了反应的快速闭管检测。灵敏度试验显示,建立的方法可以检出稀释至3.6×10~1 CFU/mL菌液所提取的DNA;特异性试验显示,建立的方法与大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA、布鲁氏菌试管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA以及猪链球菌2型DNA不发生交叉反应,但能检出鸡白痢、禽伤寒沙门氏菌凝集抗原以及马流产试管凝集抗原提取的DNA;重复性试验显示,3个稀释度菌液DNA的3次重复检测均为阳性;应用试验显示,从经增菌培养的200份进境猴粪拭子样品中检出阳性2份,与细菌分离鉴定检测结果一致。结果表明,所建立的方法敏感性和特异性较高,重复性满足实际要求,可用于进境动物样品的沙门氏菌检测。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

燕麦核不育雄蕊转录组测序及分析

以重组自交构建的燕麦（Avena L.）近等基因系为研究对象,通过构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq双端测序及生物信息学分析,了解雄蕊生长发育过程,特别是花粉发育基因调控过程。共获得原始数据23.13 Gb,有效数据20.61 Gb。通过 de novo拼接,获得的 unigene 总长度约为 95.95 Mb,均contig长度为716 nt,N50长度为1.07 kb。转录物注释结果显示,82992条转录物序列具有同源比对信息,COG和GO 功能分类工具分别将已注释转录物序列划分为 25个和56 个功能类别。通过对2个材料间转录物序列及表达水平比较,初步确定在雄蕊形成过程中3643条序列表达量上调,50条序列表达量上调10倍以上;12312 条序列表达量下调,2041条序列表达量下调10倍以上。     

肠炎沙门菌icdA基因缺失株的构建及重要特性分析

为研究肠炎沙门菌异柠檬酸脱氢酶(IDH)的功能,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌IDH编码基因icdA缺失突变株c50336ΔicdA,对其进行生长和生化特性检测,并通过体外模拟应激试验、药敏试验、生物被膜检测、抗蛋清杀伤、胞内存活和动物感染实验,分析icdA基因在肠炎沙门菌致病机制中的重要作用。研究结果显示,icdA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长特性和生化特性,在热应激(42℃)、酸应激(pH3.5)和高渗应激(NaCl2.4mol/L)条件下其存活率也未出现显著变化,但icdA基因缺失能够显著降低肠炎沙门菌对碱、低渗透压和过氧化氢应激的抵御能力,降低肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药性和生物被膜的形成能力;同时,该基因缺失能够降低肠炎沙门菌对蛋清杀伤的防御能力、在巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力。研究结果表明icdA基因参与肠炎沙门菌的抗应激能力、耐药性、生物被膜形成和抗蛋清杀伤能力,从而影响细菌的毒力。本研究为肠炎沙门菌疫苗的研究奠定了重要基础。     

基于RNA-seq对猪瘟病毒感染宿主的转录组学研究进展

对转录组测序(RNA-seq)的技术特点及其发展进行概述,对该技术在猪瘟感染研究中的应用进行详细综述,并对其存在的问题及未来发展做了进一步展望,以期为猪瘟的相关研究提供参考。