猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)美洲经典株国家核酸标准物质,将美洲经典株代表PRRSV VR2332接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值和临床试用。结果表明制备的标准物质的定值为(2. 06±0. 31)×104copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上、4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV美洲经典株核酸标准物质。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)国家核酸标准物质,将PRRSV美洲变异株代表毒株PRRSV JXA1接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果表明,制备的标准物质的定值为:(1.13±0.18)×10~4拷贝/μL,样品均匀;-20℃可稳定保存12个月以上、4℃可稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质要求,可以作为核酸扩增检测PRRVS的核酸标准物质。     

非洲猪瘟病毒国家标准物质的研制

为了研制非洲猪瘟病毒国家标准物质,构建了含有非洲猪瘟病毒的P72基因序列的质粒pUC19-P72,并对质粒溶液进行了稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果表明,制备的标准物质的定值为:(5.8±0.9)×10~3个拷贝/μL;均匀性良好;-20℃可稳定保存12个月、4℃可稳定30 d、25℃可稳定15 d,37℃可稳定9 d。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的非洲猪瘟病毒的标准物质。     

猪瘟病毒C株检测用国家核酸标准物质的研制

为研制均匀、稳定的猪瘟病毒（CSFV）核酸标准物质,选择CSFV C株接种于PK-15细胞并收获病毒液,然后经过病毒灭活、分装、冻干,最终形成核酸标准物质。用微滴式数字PCR对制备的CSFV标准物质进行均匀性和稳定性评估、标准物质合作定值,在评定不确定度后计算得出最终量值结果,并开展临床试用。结果显示,该标准物质均匀,4 ℃条件下可稳定存放4周,25 ℃可稳定存放1周,-20 ℃可稳定存放11个月,量值结果为（5.1±0.7）×105 copies/mg;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样本的互通性良好。本研究制备的CSFV C株国家核酸标准物质均一性良好、稳定、量值准确度高,并通过了全国标准物质管理委员会评定,可用于动物及动物产品质量安全检测,从而有效保障猪瘟防治工作的开展。     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

狂犬病病毒LN34基因假病毒核酸国家标准物质的研制

LN34基因作为狂犬病病毒核酸诊断的首选基因已被广泛应用,但检测活动中涉及生物安全要求以及缺少相应的核酸标准物质,导致很难对现有核酸诊断方法进行有效评价。本研究以慢病毒为表达载体,制备了含有狂犬病病毒LN34基因的假病毒核酸标准物质,并对该标准物质开展了均匀性、稳定性评估以及数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果显示：制备的标准物质定值为(1.33±0.23)×10⁴拷贝/μL,样品均匀;-20℃条件下可稳定保存6个月,4℃可稳定保存9 d,25℃可稳定保存1 d。本标准物质的研制为相关实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供了技术支撑。     

新城疫病毒LaSota株检测用国家核酸标准物质的研制

为满足禽类及禽类产品质量安全检测领域对标准物质的需求,将新城疫病毒(NDV)LaSota株接种于9日龄SPF鸡胚,72 h后收集鸡胚尿囊液,经灭活后分装、冻干,制备新城疫病毒LaSota株核酸标准物质。对该标准物质开展了均匀性评估、稳定性评估、标准物质定值、不确定度评定和临床适用性评价。结果表明,该标准物质均匀性、稳定性良好,4℃环境下可稳定4周,在-20℃环境下可稳定保存11个月,经8家实验室合作定值和不确定评定,其定值结果为1.7×10~5 copies/mg±0.3×10~5 copies/mg。经3家临床试用单位试用证实,其量值的准确度高,与临床样本互通性好。     

病毒性出血性败血症病毒RNA标准物质的研制

利用基因克隆和体外转录技术制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)核酸检测标准物质。设计VHSV N基因的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品。初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准物质候选物。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量(拷贝数),并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20℃~25℃(相对湿度20%~25%)7 d,2℃~8℃保存1个月及-20℃保存6个月的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为(6.625±0.149)×10~8copies/μL,可用作VHSV核酸检测的标准质控品。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

病毒性神经坏死病病毒核酸检测用标准物质的制备

利用基因克隆和体外转录技术,制备病毒性神经坏死病病毒(Nervous necrosis virus,NNV)核酸检测标准物质。设计NNV RNA2基因的特异性引物,通过RT-PCR获得目的片段并连接至p GEM-T载体;采用体外转录方法,获得大量纯品RNA。初步定量稀释至约10~8 copies/μL,均匀性检验结果显示样品间差异5%;稳定性检验表明,室温(20~25℃)保存7 d、冷藏(2~8℃)保存1个月和冷冻(-20℃)保存6个月的含量均无明显变化。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法,对转录的RNA片段进行定值,并根据委托单位的定值结果进行不确定度估算。核酸标准物质定值为(8.452±0.068)×10~8 copies/μL,可用作NNV核酸检测的标准质控品。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

猪圆环病毒3型感染的流行情况与检测方法研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016—2017年,世界范围陆续报道在猪群中发现PCV3,包括美国、中国、美国、韩国、巴西、波兰和意大利等。PCV3感染多见于具有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,目前病毒尚未分离成功。本文综述了已报道的PCV3在世界范围内的流行情况,介绍了当前研究的PCV3分子和血清学诊断方法。     

小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立

通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。     

安徽省合肥市家禽高致病性禽流感血清学调查

2017年秋,我国开始采用高致病性禽流感(H5+H7)二价灭活疫苗,对家禽实行强制免疫。为评价该疫苗在合肥市家禽中的免疫效果,科学制定该地区免疫计划和防控措施,2017年10月—2018年10月,在春季和秋季集中强制免疫后,分别随机抽取养殖场、交易市场和自然村散养户家禽血清样品,进行3次集中抗体监测;在2018年春季集中免疫前和免疫后,选取22个固定家禽养殖场,开展定点抗体监测。集中监测结果显示:高致病性禽流感抗体场点合格率从2017年秋季的48.0%,分别提高到2018年春季的96.6%和秋季的95.5%,2018年的H5、H7亚型个体合格率均高于2017年秋季水平,差异均有统计学意义(P<0.01)。定点监测结果显示:免疫后21d,H5亚型禽流感抗体个体合格率由92.6%降到58.2%,但60d后又大幅回升到90.8%,差异极显著(P<0.01);而H7亚型抗体合格率却直线上升,个体合格率差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果表明,高致病性禽流感(H5+H7)二价灭活疫苗防护效果较好,可显著提升H5和H7亚型抗体场点合格率和个体合格率,使其达到免疫保护水平,因此应继续加强该疫苗的免疫、监测,根据实际情况及时补免。     

牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛病毒性腹泻病毒P80蛋白抗原,经纯化鉴定后将P80蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的P80抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛病毒性腹泻病毒抗体快速诊断试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测80头份牛血清,阳性结果符合率为86.7%,阴性结果符合率为100%,总符合率为95%。该试纸条可用于临床牛病毒性腹泻病毒抗体的诊断和检测。     

山西省晋中市规模猪场母猪伪狂犬病群流行率及感染风险因素横断面研究

为了解2018年山西省晋中市规模猪场母猪伪狂犬病血清学场群流行率,寻找猪伪狂犬病毒感染的潜在风险因素,以母猪存栏大于100头的75个规模猪场为研究目标,按照发现疫病的抽样策略,采用两阶段抽样方法,随机选取51个规模猪场,在每个养殖场随机抽取30份血清样品进行感染抗体检测,并对所有检测的规模猪场开展问卷调查。抗体检测结果显示,晋中市规模猪场母猪伪狂犬病场群流行率为40.90%(95%CI:27.3%～54.5%)。单因素分析显示,风险因素为"方圆3 km内有其他家畜养殖场、交易市场或者屠宰场",保护性因素为"引进猪只时检测伪狂犬病毒感染抗体和1年内引进公猪精液"。建立的模型拟合度较好,模型ROC曲线下面积为0.835(95%CI:0.658～1.000)。调查结果提示,新建养殖场要与其他的家畜养殖场、交易市场或者屠宰场保持安全的养殖距离,规模养殖场要坚持自繁自养,在引进种猪和公猪精液时一定要进行严格地PRV检测。     

天津市某鸡场高致病性H7N9流感紧急流行病学调查

2017年5月13日,天津市某蛋鸡场出现疑似流感疫情,发病鸡伴有呼吸困难、咳嗽等症状,死亡率持续升高,经国家参考实验室确诊为高致病性H7N9流感疫情。为查找可能风险因素并提出防控建议,进行了紧急流行病学调查。结果显示,本次疫情袭击率为10.8%,车流、人流以及野鸟带毒入场可能是引起疫情的主要原因。本次疫情得到有效处置,未发生扩散。     

银杏叶多糖对传染性法氏囊超强毒灭活疫苗的免疫调节作用

用改进水提醇沉法提取银杏叶多糖。用灭活的传染性法氏囊超强毒(vvIBDV)GX8/99细胞适应株分别制备不同质量浓度(40,20,10 g/L)银杏叶多糖佐剂疫苗、弗氏不完全佐剂疫苗和无佐剂疫苗。360只SPF公雏鸡随机均分为6组,其中5组SPF鸡分别免疫上述5种疫苗,另外1组SPF鸡不免疫作为阴性对照。检测IL-2和IFN-γ分泌量、血清抗体、外周血淋巴细胞转化率、外周血CD4^+和CD8^+T淋巴细胞数量等用来评价疫苗的免疫效果。38日龄进行攻毒试验,评价疫苗的保护效果。结果显示,银杏叶多糖佐剂疫苗组各免疫指标均显著高于弗氏佐剂和无佐剂疫苗组(P<0.05);40 g/L银杏叶多糖佐剂疫苗组免疫效果最好,但与20 g/L银杏叶多糖佐剂疫苗组差异不明显,并且2组攻毒保护率无显著性差异。结果表明,银杏叶多糖作为vvIBDV疫苗佐剂具有良好的免疫促进作用,且20 g/L的银杏叶多糖即可达到最佳效果。     

一起野猪猪瘟感染的诊断

2018年9月,贵州省某乡镇一野猪养殖场30%左右的仔猪出现食欲废绝、先便秘后腹泻、呼吸困难、逐渐消瘦等症状,死亡率为75%。通过临床病理变化及实验室检测,结合流行病学调查,确诊为猪瘟病毒感染。分析认为,引起此次感染的主要原因是该养殖场未对新增仔猪及怀孕母猪及时进行猪瘟免疫。     

河南省某县羊群布鲁菌氏病横断面调查及感染风险因素分析

为了解河南省羊布鲁氏菌病流行现状以及羊养殖场感染风险因素,按照两阶段抽样检测方法,采集某县羊养殖场和散养村的羊血清样品,采用虎红平板凝集和试管凝集垂直试验进行布鲁氏菌检测。结果显示,该县散养村的羊布鲁氏菌病表观群体流行率为16.35%,真实群流行率为18.17%(95%CI:12.14%~24.20%),养殖场的表观群体流行率为22.22%,真实群流行率为25.60%(95%CI:13.87%~37.33%)。风险因素分析结果显示,“羊贩随意进出养殖场(OR=18.50,95%CI:1.82~188.39)”和“共用种公羊(OR=12.00,95%CI:1.11~129.42)”是该县羊养殖场感染布鲁氏菌的主要风险因素。结果表明,该县羊布鲁氏菌病流行较为严重,提示该县需要加强布鲁氏菌病防控,提高养羊场户的生物安全管理水平,加强散养村内种公羊的布鲁氏菌监测与净化,及时淘汰阳性羊。