广西北部湾地区猪圆环病毒2型检测及其ORF2遗传变异分析

为了解猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在广西北部湾地区的流行情况和其ORF2基因的遗传变异规律,本研究采用PCR方法对2016年采自广西北部湾地区规模猪场和农村散养户的306份疑似PCV2感染猪的血液和组织样品进行了PCV2的病原学检测,同时对分离的4株PCV2 ORF2基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中登录的34株国内外PCV2参考株ORF2序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性样品为129份,阳性率为42.16%。随机选取的4份阳性病料PCV2 ORF2基因测序结果显示,4个毒株遗传关系上均属于Group 1(PCV2b),其中BBW-1和BBW-2分离株属于1A分支且分别与Fd3株(AY321984)和NL_PMWS_3株(AY484415)同源性较高,BBW-3和BBW-4分离株属于1B分支且BBW-4分离株与Hu Zhou0301株(AY536756)和NL_Control_1株(AY484407)同源性较高,其ORF2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%~99.5%和93.9%~95.4%,说明该地区PCV2的优势基因型是PCV2b。研究结果不仅有利于掌握广西北部湾地区PCV2流行毒株同源性情况,而且将为该地区(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的防治和新型疫苗的研制提供依据。     

河北北部猪圆环病毒2型流行毒株的遗传变异分析

为了掌握河北北部地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法对2015—2017年间收集的河北北部猪场86份临床病料进行PCV2检测,并对阳性毒株的全基因进行扩增、克隆和测序。结果显示,86份临床样品中,有38份样品为PCV2阳性,阳性率为44.19%,选取11株进行病毒全基因扩增,并利用序列比对软件进行遗传变异分析发现,11株病毒之间同源性为95.9%～99.9%,与各参考毒株之间同源性为93.5%～99.9%。在遗传进化关系上,11株病毒分别处于2个分支:PCV2b和PCV2d,表明河北北部地区PCV2流行比较广泛,并且以PCV2b和PCV2d毒株流行为主。本研究充实了河北北部地区PCV2流行病学调查资料,也为河北PCV2疫苗株的研发和选择提供了依据。     

云南省新发猪圆环病毒3型感染状况调查与全基因进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在云南省不同地区猪群中的流行情况,针对PCV3基因保守区域设计特异性引物,优化反应条件,建立PCR快速检测方法,并采用该方法对采自云南省不同地市431份样品进行检测,将获得的部分毒株全基因序列进行遗传进化分析。结果显示:本研究成功建立了一种快速、特异和灵敏的PCV3检测方法;云南省12个地(市)29县(区)中,8个地(市)12个县(区)检测出阳性样品;431份样品中有43份PCV3阳性样品,阳性率为9.98%;获得的3株PCV3全基因组序列与参考毒株之间的核苷酸同源性为98.6%~99.5%,进化树显示3株云南毒株形成一个小的进化分支,属于PCV3a基因型。本研究结果表明,PCV3在云南省多个地区呈一定的流行趋势,流行毒株以PCV3a基因型为主,有必要进一步开展云南地区PCV3流行病学调查,并提出防控对策。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

猪圆环病毒2型广东分离株的遗传演化分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异情况,从广东不同地区的规模化猪场采集疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪的淋巴结、肺脏和脾脏。对PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上增殖培养6代,采用PCR和相关分子生物学软件对12个分离株进行全基因组克隆和测序分析。结果显示,分离株基因组全长为1 767 nt或1 768 nt,核苷酸序列同源性为94.6%~99.9%。遗传演化分析表明,12个分离株分布于3个大群,其中5株属于PCV2b,4株属于PCV2d,3株属于PCV2e,提示广东地区PCV2流行毒株已发生变化。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

2017~2018年华中地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

为了解华中地区近年来猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行情况,本中心对来自华中地区湖北、湖南、河南的1592份疑似PCV2感染病料进行了PCR鉴定,对部分阳性样品进行ORF2基因的克隆与测序,并进行同源性分析和遗传进化分析。结果表明:1592份样品中,有1091份样品检测为PCV2阳性,阳性率为68.53%,3个省份的PCV2感染率相近;其中38株PCV2 ORF2基因序列同源性为89.5%~100%,与参考序列的同源性为81.1%~99.9%;遗传进化分析显示,33株序列为PCV2d基因型,4株序列为PCV2b基因型,1株序列为PCV2a基因型。本研究结果表明,2017~2018年间华中地区PCV2流行的基因型以PCV2d为主,该结果对临床上PCV2的防控具有一定的指导意义,同时也为PCV2新型疫苗的研制积累了有效材料。     

云南省部分猪场病料猪圆环病毒3型PCR检测及克隆测序

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在云南省的流行及遗传进化情况,2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份,采用PCR方法进行PCV3病原检测;选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序,并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示:24份病料样品中检出阳性5份,阳性检出率为20.8%;克隆出的阳性扩增产物(YNJS-2020)ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高,为97.4%～98.9%,其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高,与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明,云南省存在PCV3流行,且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近,但也有一定差异。结果提示,云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制,避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。     

华南地区猪圆环病毒3型感染的分子流行病学调查与分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)在我国华南地区的感染情况,从2016年12月到2017年12月期间,从广东、广西、海南、福建、江西和湖南的177家规模化猪场采集1 078份病料,利用PCR技术检测PCV3的流行情况,并对PCV3阳性病料进行全基因组测序分析。结果显示:样品阳性率为29.04%(313/1 078),猪场阳性率为44.63%(79/177);从病料中测得的10株PCV3毒株全基因组核苷酸序列相似性为98.8%~100%,与国内外其他毒株的同源性在98.2%~100%之间;全基因组遗传进化分析显示PCV3遗传进化可以分为PCV3a和PCV3b,其中毒株CHN/HUNAN、CHN/GD-SH和CHN/GD-ZQ属于以美国毒株US/MO2016为代表的PCV3a分支,其余7个毒株属于PCV3b分支。结果表明:PCV3广泛存在于华南地区的猪群中,其基因组在不断进化,对PCV3的流行与致病机理有待进一步研究。     

1株犬源PCV3的全基因克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3%。本试验成功扩增1株2 000 bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5。将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%～100.0%,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高。应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood (ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远。结果表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。     

猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立

为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。     

非典型猪瘟病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法C_t值与标准品在1.49×10~1～1.49×10¹⁰ copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R^20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

低蛋白、低钙磷日粮添加苯甲酸对生长肥猪生长性能及钙磷代谢的影响

文章旨在研究日粮降低粗蛋白质、钙和磷水平,同时添加苯甲酸对仔猪生长性能、钙磷代谢的影响。试验采用2×2多因素试验设计,选择平均体重接近12 kg的保育猪500头,分为4组,每组5个重复,每个重复25头猪。试验日粮共4个,即低水平日粮(低蛋白、低钙磷)组,高水平日粮组(高蛋白、高钙磷),低水平日粮+15 g/kg苯甲酸组,高水平日粮+15 g/kg苯甲酸组。低水平日粮组较高水平日粮组显著降低了仔猪的生长速度(P <0.05),使25 kg阶段仔猪的采食量显著降低了13%(P <0.05)。低水平日粮添加苯甲酸较较高水平日粮组显著降低了25和40 kg猪尿液pH(P <0.05)。低水平组显著降低了钙、磷摄入量及粪中钙磷含量(P <0.05)。日粮添加苯甲酸可以显著降低尿钙排泄量和提高尿磷排泄量(P <0.05)。低水平日粮显著提高了血清钙水平及碱性磷酸酶活性(P <0.05)。低水平日粮组显著降低了血清磷水平(P <0.05),而高水平日粮+苯甲酸组较高水平日粮组显著提高了血清碱性磷酸酶活力和血清磷水平(P <0.05)。日粮添加苯甲酸可以影响磷的消化率,提供仔猪生长早期血清碱性磷酸酶活力,对生长后期猪的骨矿化无显著影响。     

树鼩源奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

树鼩是最接近灵长类的动物,也是医学临床研究的重要模型动物,但是在人工驯化时饲养不当和环境因素不良,会造成较大的经济损失。为确诊广西南宁市某大学人工驯化养殖树鼩发生死亡的原因,从发病树鼩肝脏和肠道中分离到可疑细菌,通过形态学观察、生理生化特性测定、16SrDNA序列进化分析,确定该菌株为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis),与GenBank收录的猪奇异变形杆菌RBX1株同源性高达99.9%。药敏试验和耐药基因检测发现,该分离菌株对红霉素、克拉霉素、奈替米星等9种药物高度敏感,对多黏菌素、恩诺沙星等3种药物中度敏感,对米诺环素、头孢氨苄、强力霉素等12种药物完全耐药,存在氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类耐药基因。致病性试验显示,该分离菌对成年昆明小鼠的半数致死量(LD50)为1.26×10^8CFU。综上所述,引起此次树鼩死亡的病原菌为奇异变形杆菌,且毒力较强,建议采用大环内脂类药物治疗。     

大肠埃希菌耐药机制研究进展

大肠埃希菌在自然界中广泛存在,在一定的条件下可以引起畜禽患病,在长期治疗过程中,由于药物的选择压力可以引起其对药物的抗性,而且耐药广泛、耐药机制复杂,给疾病临床治疗带来了一定的困难。大肠埃希菌耐药机制主要包括细胞膜通透性改变、细菌产生灭活酶或者钝化酶、靶点结构改变、主动外排泵、质粒介导的大肠埃希菌耐药等。论文介绍了我国部分地区畜牧业中大肠埃希菌耐药现状、大肠埃希菌耐药机制以及应对大肠埃希菌耐药的策略,以便了解耐药大肠埃希菌的传播特点,为防治大肠埃希菌耐药性产生和临床治疗大肠埃希菌感染提供一定的理论指导。     

氟苯尼考耐药基因floR LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且可定量检测氟苯尼考耐药基因floR的环介导等温扩增方法(LAMP),根据GenBank登录的革兰阴性菌floR基因保守序列,利用PrimerExploerV4设计特异性LAMP引物,成功建立了快速检测氟苯尼考耐药floR基因的LAMP方法。该LAMP检测方法反应温度为63℃,反应时间为60min,具有可实时监测反应、定量检测出floR基因的拷贝数,以及操作简便的特点,灵敏度高,检测限为6.24×100拷贝,是普通PCR的100倍。用建立的方法检测对氟苯尼考不同敏感性的大肠埃希菌floR基因,结果显示,对氟苯尼考敏感、中介和耐药的菌株均检测到floR基因,其拷贝数与菌株MIC相关,提示floR基因不仅存在于氟苯尼考耐药菌中。所建立的floR基因LAMP检测方法可为floR基因的监测,以及氟苯尼考耐药性产生和传播机制的研究提供新的技术手段。     

苦白石颗粒靶动物(猪)安全性试验

为评价苦白石颗粒对靶动物(猪)的安全性,为临床应用提供依据。将苦白石颗粒按临床推荐剂量的1、3、5、10倍剂量连续拌料给药5d。从喂药第1天开始,连续观察14d;测定给药前、给药后第7天和第14天试验猪的体重、血液常规指标、血液生化指标。结果表明,苦白石颗粒按临床推荐剂量1、3、5、10倍剂量应用,猪的体重、血液常规指标、血液生化指标等与对照组相比较差异均不显著(P>0.05)。表明苦白石颗粒按临床推荐剂量的1倍~10倍范围内应用,对靶动物(猪)是安全的。     

鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR检测方法的建立及初步应用

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的3′端非编码区保守区域,设计并合成一对特异性引物,建立IBV纳米PCR检测方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果显示:该方法特异性良好,能从4种不同基因型IBV核酸样品中检测到约346bp的目的条带,而对禽偏肺病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸭肝炎病毒等其他病原检测结果均为阴性;敏感性试验表明,纳米PCR的最低检测浓度为1.01×10^-4ng/μL,其敏感性是普通PCR的10倍;重复性试验显示3次均能检出IBV核酸。纳米PCR方法的临床应用表明,送检样品及攻毒鸡样品的检出率分别达到50%(10/20)和60%(30/50),与普通PCR方法检测结果符合率为100%。研究建立的IBV纳米PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性,为IBV的临床诊断、病原检测和流行病学调查提供了新的技术手段。