粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS：：PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中，构建重组布鲁菌M111（pBBRlMCS：：PR-PL-E）。重组菌株在28℃培养，42℃诱导表达裂解酶E，从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线，计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示，成功制备了布鲁菌菌壳，温控裂解质粒pBBRIMCS：：PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100％。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出，细菌表面出现不同程度的皱缩，细胞形态发生变化。结果表明，本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳，初步研究了其基本特性，为下-步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS∷PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中,构建重组布鲁菌M111(pBBR1MCS∷PR-PL-E)。重组菌株在28℃培养,42℃诱导表达裂解酶E,从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线,计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示,成功制备了布鲁菌菌壳,温控裂解质粒pBBR1MCS∷PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100%。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出,细菌表面出现不同程度的皱缩,细胞形态发生变化。结果表明,本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳,初步研究了其基本特性,为下一步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备简

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174 DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件（protein lysis component,PLC）,该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42 ℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。     

表达Omp31基因重组牛布鲁菌的构建及鉴定

为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。     

流产布鲁菌LysR家族转录调控子LTTR8缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab＿RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明：ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现：lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢（H2O2）和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的安全性和免疫原性

以粗糙型布鲁菌M111株和重组裂解质粒制备出布鲁菌菌壳,利用小鼠模型对布鲁菌菌壳、布鲁菌M111活菌和福尔马林灭活菌的安全性和免疫原性进行比较研究。结果显示,与布鲁菌弱毒菌株M111比较而言,布鲁菌菌壳具有更好的安全性,免疫小鼠后能产生与弱毒菌株相似的血清抗体水平、脾CD3+和CD4+T淋巴细胞反应,甚至产生更高水平的IFN-γ。这些结果表明,布鲁菌菌壳具有与弱毒菌株相似的体液免疫和细胞免疫能力,将来可能作为预防布鲁菌感染的新型候选疫苗,但布鲁菌菌壳疫苗的有效性和特异性免疫机制还有待深入研究。     

单核细胞增生李斯特菌prfA基因重组菌的构建及其生物学特性研究

为制备单核细胞增生李斯特菌(LM)减毒的prfA基因重组菌,本研究通过构建重组质粒pKSV7-ΔprfA-gfp,电转化至LM TA感受态细胞中,将绿色荧光蛋白基因gfp插入LM的prfA基因第25 bp～93 bp之间,在42℃和10μg/mL氯霉素的双重选择压力下,筛选LM重组菌(rLM-ΔprfA-gfp),并对其生物学特性进行鉴定。试验结果表明,重组菌与亲本菌相比具有相似的体外生长特性,溶血素基因(hly)mRNA的转录水平降低;对小鼠的毒力显著减弱,其LD50由105.53升高到109.79,对肝、脾、肾的损伤不明显;免疫保护力试验显示重组菌与LM TA灭活疫苗的保护率分别为90%和35%,表明rLM-ΔprfA-gfp比传统疫苗具有更高的保护力。本研究构建的rLM-ΔprfA-gfp具有良好的遗传稳定性,并且具有较好的免疫原性,为LM活疫苗载体和分子标记疫苗的研制奠定了基础。     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达

本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸p-半醛脱氢酶基因（Aasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。     

致禽肾脏、肠道病变大肠杆菌菌影的制备及其裂解效率的测定

为制备高裂解效率的致禽肾脏、肠道病变大肠杆菌菌影,本研究通过编码15个柔性氨基酸linker采用融合PCR法将噬菌体中Φ174的裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)串联(E-15L-SN),插入温控表达质粒pBV220,构建重组温控双裂解表达质粒(pBV-ES),采用PCR扩增其温控双基因裂解表达盒(DLS-ES)插入E.coli-Pasteurella(大肠杆菌和巴氏杆菌)穿梭质粒pBA1100,构建重组温控双基因裂解穿梭质粒pBA1100-DLS-ES。该质粒可以通过温控制备高裂解率的E.coli和Pasteurella两种菌的菌影。本实验将构建的pBA1100-DLS-ES电转化至致禽肾脏、肠道病变E.coli中,28℃集菌,42℃温控诱导裂解蛋白E和核酸酶A表达。OD_(600nm)值及电镜结果表明,双基因裂解率高于单基因,同时收集菌影时间也比单基因裂解短,42℃诱导2 h含双裂解基因的菌液处理菌体裂解率达到99.9999%,本实验利用菌影形成机制将含青霉素抗性的致禽肾脏、肠道病变E.coli制备成菌影,为新型菌影疫苗的制备提供实验依据。