多重实时荧光PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒方法的建立以及初步应用

本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)检测方法,并对REV在鸡胚成纤维细胞(chick embryo fi broblast,CEF)上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计3对引物,利用重组质粒作为模板,绘制3种不同基因的标准曲线。检测结果显示,本研究建立了多重实时荧光PCR检测方法,所制备的标准品模板在108~101copies范围内与Ct值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷贝数均先减少后增多。通过实时荧光PCR技术与间接免疫荧光方法检测,发现REV在CEF上复制的初始阶段呈现病毒适应过程,此后病毒大量复制,表现出明显的增长趋势。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法,同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。     

REV感染SPF鸡中白细胞介素18的定量检测

建立并利用鸡白细胞介素18（chicken interleukin-18,ChIL-18）荧光定量RT-PCR方法,对于禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）感染SPF鸡后主要免疫器官的IL-18mRNA转录水平进行了初步研究。结果表明,与对照组相比,处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平除感染后14d脾脏外,在感染后7,14,21,28,35,42,49d均显著升高（P〈0.05）。本研究为探讨REV感染的免疫抑制机理打下了一定基础。     

SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法检测禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒

为快速、准确检测禽活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),根据REV p30基因上的一段保守序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法,并以常规PCR产物为标准品绘制了标准曲线,对方法的特异性、敏感性、重复性、与经典方法的符合率进行了评价。结果表明:扩增产物片段大小为222 bp,与预期片段大小相符,测序结果证实为REV靶序列;标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为1.0,扩增效率为94.2%,溶解温度Tm=(86.0±0.50)℃,无引物二聚体;该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,其他病原无扩增信号,特异性好;最低可检测26.97拷贝数的阳性标准品,比常规PCR敏感1000倍;组内变异系数、组间变异系数分别为0.79%~5.36%,1.61%~5.25%。运用建立的实时荧光PCR方法对17批禽用活疫苗进行检测,并与间接免疫荧光法(IFA)进行同步比较试验,结果两者符合率为100%。且实时荧光PCR法更快捷、更方便,结果判定更为直观可用于疫苗中REV污染情况的监测。     

鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立鸡胚致死孤儿病毒CELO的荧光定量PCR检测方法,实现该病毒在鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测.方法根据CELO L5纤突1序列设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度进行考察.运用建立的方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种进行CELO检测.结果:建立的荧光定量PCR其最佳线性范围为1x109~1x104拷贝/μl,R2值达0.99以上,特异性良好,与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应,灵敏度为102拷贝/μl;荧光定量PCR方法检测40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感毒种结果为阴性.结论:本研究所建立的鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法,特异性好,敏感性高,为鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测提供了技术支撑.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测网状内皮增生症病毒方法的建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR GreenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR GreenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。     

SPF雏鸡感染REV后IL-2 mRNA表达的动态变化

为研究SPF鸡感染禽网状内皮组织增生症病毒(REV)后白细胞介素2(IL-2) mRNA表达的动态变化,本研究应用荧光定量RT-PCR方法,对SPF鸡感染REV后主要免疫器官的IL-2 mRNA转录水平进行了初步研究.结果显示,与对照组相比,REV感染组鸡的脾脏、胸腺和法氏囊中IL-2基因的表达量在感染后7d、14d、21d、28 d、35 d、42 d和49 d均呈现升高,而且除21日龄、28日龄鸡的脾脏外,均为差异显著(p＜0.05).本研究表明REV感染后可以诱导鸡的机体表达IL-2.     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

实时荧光PCR检测鸡GAPDH基因方法的建立

根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料建立了荧光定量PCR法.采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应.实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

实时荧光PCR法检测饲料中鸡源性成分

为控制由动物源性饲料引发的国际和国内动物安全问题提供依据,有必要的进行动物源性饲料中动物种类进行鉴定,本研究根据鸡线粒体DNA建立了Taqman探针实时荧光PCR检测饲料中鸡源性成分方法,该方法的特异性高、灵敏性高、重复性好,在检疫检验部门极具实用价值。     

荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用

实时荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,成为当前疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。本文就实时荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用作一综述。     

实时荧光定量PCR检测高温即时浸酸对蚕卵中家蚕微孢子虫的灭活效果

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)引起的家蚕微粒子病是对蚕种生产危害最为严重的家蚕病害,蚕种浸酸处理是蚕业生产中常用的一种防病处理手段。为探明浸酸处理对家蚕微粒子病的防治效果,将家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒蚕卵分别进行常规即时浸酸处理和高温即时浸酸处理,采用实时荧光定量PCR对卵龄24~240 h蚕卵中的家蚕微孢子虫进行定量检测。结果发现,常规和高温浸酸处理后每日取样蚕卵中家蚕微孢子虫的检测值较阳性对照组均显著降低,高温浸酸组又明显低于常规浸酸组,表明2种浸酸处理对蚕卵中的家蚕微孢子虫均有灭活作用,且高温处理的灭活效果更为显著。对蚕卵孵化后饲养至3龄眠和5龄起的幼虫逐条进行显微镜镜检,结果显示高温即时浸酸处理对家蚕微粒子病的相对防治效果分别为92.30%±2.95%和81.80%±0.06%。综上表明,高温即时浸酸处理带毒蚕卵对家蚕微粒子病有显著的防治作用。     

荧光定量RT-PCR检测猪日本脑炎病毒

通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量R-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%.对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度.     

实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.     

Real—time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法.通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高.通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率.     

Establishment of the Quantitative Real-time PCR Method for PRRSV Nsp9 Gene Rapid Detection and Its Expression in PRRSV Infected Cells

The study was conducted to establish a quantitative Real-time PCR method for PRRSV Nsp9 gene rapid detection and study its expression in PRRSV infected cells.A pair of specific primers targeted to Nsp9 of PRRSV was designed and a Real-time PCR method based on SYBR Green Ⅰ fluorescent was developed for the quantization of PRRSV.The melting curve analysis using SYBR Green Ⅰ dye showed one specific peak,and no primer dimers peak was observed.No amplification was detected from HEV,SIV and PRV samples by this method.There was good reproducibility and low variation coefficient.The quantitative Real-time PCR method developed in this study would be useful for rapid laboratory diagnosis and epidemiology investigation of PRRSV.During the process of virus infecting cells,the expression level of Nsp9 increased gradually,and it got the highest at 36 h.This study laid the theoretical basis to explore the law of virus replication and clinical vaccine production.     

猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

Establishment and Application of Quantitative Real-time PCR Detection Method for Feline Infectious Rhinotracheitis Virus

Feline herpesvirus type 1 (FHV-1) is the pathogeny of feline infectious rhinotracheitis.Based on the sequence of gD gene of FHV-1, one pair of primers(FHV-1F and FHV-1R) and FHV-1Probe were designed for the quantitative Real-time PCR detection method.The results showed that the method could detect FHV-1 DNA specifically and the sensitivity was 75 fg/μL.The reaction efficiency reached 107%, and the R² value was 0.9965.The coefficient of variance(CV) was below 2%.And the method was more sensitive than common PCR.It was specific, stable, and suitable for clinical diagnosis, detection and epidemiological investigation.Using this method, the Shanghai area pet clinic censorship suspected FHV-1 infected samples were detected, and the positive rate reached 27.78%, which indicated that the incidence of FHV-1 in Shanghai area was at a high level.     

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSVNsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×10⁴~1×10⁸拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36 h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。