欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

用PCR的方法从甘露聚糖酶高产菌欧文氏杆菌CXJZ95-198中克隆到甘露聚糖酶基因manA全长以及其N端缺失81、111、141 bp的片段,连接到pET28a载体再转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用透明圈法鉴定其酶活性.结果表明,删除了manA N端111 bp的翻译产物依然具有酶活性,删除了N端141 bp的翻译产物无酶活性,manA N端111～141 be可能具有重要意义.     

CXJZ95-198菌株β-甘露聚糖酶的纯化条件研究

研究通过超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀及凝胶层析等纯化步骤,将CXJZ95-198菌株所分泌的β-甘露聚糖酶进行了纯化,其纯化倍数为12.05,收率为33.50;.通过SDS-聚丙烯酰胺电泳得到单一条带蛋白,分子量为52.29 kD.     

β-甘露聚糖酶基因高效表达体系的构建

为构建-β甘露聚糖酶基因高效表达体系,采用重叠区扩增基因拼接法将苏云金芽孢杆菌(Bacil-lus thuringiensis)CTc S-层蛋白启动子和欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)CXJZ95-198 β-甘露聚糖酶基因完整开放阅读框定向连接,得到基因拼接体slp-man.将 slp-man 克隆到高效表达载体 pET-28a+上,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中.结果表明,β-甘露聚糖酶基因高效表达体系构建成功,重组茵发酵11 h酶活达到671.3 U·mL-1,是欧文氏杆菌CXJZ95-198的1.48倍.     

甘露聚糖酶基因3'端缺失研究

[目的]初步研究甘露聚糖酶基因3’端对甘露聚糖酶功能的重要性。[方法]以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。[结果]删除甘露聚糖酶基因3’端246bp后甘露聚糖酶依然具有酶活性。[结论]甘露聚糖酶基因3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

β-甘露聚糖酶异源表达及甘露寡糖制备研究

以产β-甘露聚糖酶(MAN)的枯草芽孢杆菌HD145为目的菌株,PCR扩增MAN基因片段,克隆到p HBM905A载体并转化至毕赤酵母,重组子利用甲醇进行诱导。纯化的MAN酶解槐豆胶与瓜尔豆胶,质谱检测水解产物。SDS-PAGE结果表明,MAN基因实现了表达,摇瓶酶活性为3 200 U/m L,酶最适温度与pH分别为55℃与6.0,pH 4~7时稳定性较好,在40、50、60℃的半衰期分别为165、105、42 min,Zn~(2+)、Ag~+、Co~(2+)对酶活性存在一定的抑制。槐豆胶与瓜尔胶经MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。     

欧文氏杆菌CXJZ11-01基因组文库的构建

采用改良鸟枪法构建了草本纤维精制高效菌种CXJZ11-01的基因组文库,通过透明圈法筛选到了2个木聚糖酶基因阳性克隆.     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

地衣芽孢杆菌W10 β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达

地衣芽孢杆菌W10菌株具有较高的β-甘露聚糖酶活性。采用PCR技术从W10基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因序列,通过克隆、测序获得1 017 bp甘露聚糖酶基因manW10,其编码338个氨基酸。以pET-22b(+)为载体和pelB为信号肽,将manW10转入EscherichiacoliBL21(DE3)中进行表达,经IPTG诱导酶活性达19.73 U.mL-1。经镍柱亲和层析获得较纯的β-甘露聚糖酶,其分子质量约为38 ku。     

β-甘露聚糖酶基因重组整合组成型表达载体的构建

应用PCR方法从P.pastorisGS115染色体中扩增了GAP启动子(PGAP),大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的AOX1启动子(PAOX1),构建了组成型表达载体pGAP;再从野生型酵母菌JSY4染色体中扩增出25S rDNA保守序列,大小为1 700bp左右,以其取代组成型表达pGAP上的组氨酸脱氢酶基因(H IS4)片断,构建了整合组成型表达载体pGAP-rDNA。再双酶切重组质粒pT002M anⅠ得编码β-甘露聚糖酶的ManⅠ基因片断插入pGAP-rDNA的多克隆位点(MCS),获得含有目的基因ManⅠ的重组整合组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ。CaC l2法转化感受态大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行质粒PCR鉴定和单、双酶切鉴定。结果表明:成功构建了重组组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ,为下一步野生型酵母菌JSY4中β-甘露聚糖酶的组成型表达打下基础。     

玉米β-甘露聚糖酶基因家族的生物信息学分析

[目的]鉴定出玉米基因组中的β-甘露聚糖酶基因(MAN),并分析其进化机制和表达模式。[方法]利用拟南芥MAN蛋白序列在玉米基因组数据库以及NCBI非冗余蛋白质数据库中比对搜索,获取玉米MAN家族全部成员;通过检索植物基因组复制数据库查找玉米MAN基因的片段复制事件;利用GSDS 2.0服务器分析基因外显子/内含子结构;采用MEGA7软件极大似然法构建系统发育树;利用芯片数据分析基因在不同组织器官中的表达模式。[结果]玉米基因组中含有6个MAN基因,分布于5条染色体上。没有玉米MAN基因起源于片段复制或串联重复事件。系统发育分析将植物MAN蛋白分为3个亚族(I～Ⅲ),说明其序列已发生分化。玉米MAN基因结构较为保守,蛋白质均含有甘露聚糖酶的核心基序。玉米MAN基因具有不同的表达模式,部分基因在发育叶片中表达量较高,部分基因在减数分裂期雄穗中表达量较高,而其余基因在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗、花丝和发育种子中表达量较高。[结论]该研究结果为进一步研究玉米MAN基因功能奠定了基础。     

转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠的制备

为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功.     

β-甘露聚糖酶的研究进展

β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类,是一种广谱诱导型多功能酶,广泛存在于动植物和微生物中,其主要水解产物为甘露寡糖,在动物生产、饲料、食品、医药、石油开采及生物技术方面广泛应用.对β-甘露聚糖酶的来源、生产、纯化、分子特性、作用机制以及微生物诱变育种等方面的研究概况进行了综述,并对β-甘露聚糖酶的应用前景进行了分析.     

Athelia rolfsii的β-甘露聚糖酶纯化研究

从发酵培养5d的产β-甘露聚糖酶的Athelia rolfsii菌株CBS191.62发酵液中经硫酸铵沉淀、琼脂糖凝胶(DEAE Sepharose Fast Flow)层析、羟基磷灰石(Hydroxylapatite)层析和冷冻干燥结晶等步骤, 获得了比活提高了15.1倍,分子量为14.7 kD的凝胶电泳均一的β-甘露聚糖酶蛋白样品.     

β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展

β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸、洗涤等工业领域应用广泛。近几年,基因测序技术飞跃发展,研究人员挖掘到许多新颖的β-甘露聚糖酶基因并对其进行了酶学性质的研究。介绍了各种类型的甘露聚糖及其降解酶,梳理了β-甘露聚糖酶的糖苷水解酶家族分类、来源、结构和催化机理,归纳总结了近几年微生物来源β-甘露聚糖酶的重组表达、酶学性质及分子改造,简述了甘露聚糖酶在食品和饲料等方面的应用,展望了β-甘露聚糖酶的研究热点及方向。     

甘露聚糖酶man23基因的重组及其在短短芽孢杆菌中的表达

为了提高甘露聚糖酶Man23的表达量,降低它的体外降解程度,将其基因连接到质粒pHY-p43上,由强启动子p43启动基因man23的表达.将构建的重组质粒pHY-p43-man23转化至短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中,经转化的B,brevis发酵后的上清液中酶活高达22480 U.mL-1,较出发菌株Bacillus subtilis B23所产生的甘露聚糖酶活力提高了26.7%.B.brevis体系的表达产物经SDS-PAGE检测,其图谱比出发菌株表达产物的更为明晰,目的蛋白带更宽,带色更深,说明目的酶的产量得到了大幅提高,表达产物得到了明显纯化.试验表明以p43为启动子,B.brevis为表达质粒的宿主菌,不仅保证了基因产物的分泌和正确折叠,而且实现了基因的高表达和产物的高活力.     

甘露聚糖酶基因Man23在芽孢杆菌WB600中的表达

兼具纤维素酶和半纤维素酶活性的Man23基因(Man23)来自于芽孢杆菌B23,将其连接到质粒pHY-P43上,由强启动子P43来启动Man23的表达,重组质粒pHY-p43-Man23转入蛋白酶缺陷型芽孢杆菌WB600中,表达产物与原体系相比,甘露聚糖酶活力提高了21%,电泳检测得到的蛋白图谱显示目的酶丰度有显著提高,杂蛋白未见大量表达,可见构建的WB600体系适用于Man23基因表达.     

甘露聚糖酶3′序列缺失与酶功能间的关系初探

初步研究了3′端对甘露聚糖酶的功能重要性,即以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3′端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性.结果表明,删除390bp依然具有酶活性,3′端的部分序列不是酶具有功能所必需的.     

甘露聚糖酶3’序列缺失与酶功能间的关系初探

初步研究了3’端对甘露聚糖酶的功能重要性,即以甘露聚糖酶的二级结构为基础．用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。结果表明,删除390bp依然具有酶活性,3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增β-甘露聚糖酶基因编码序列．经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员，该基因已往册GenBank．将该基因克隆到原核表达载体pRSET—A中并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3）pLysS，经过诱导获得了此酶的高效表达．其表达量达到37．78U／mL。酶学特性分析表明其作用的最适pH为5．0．最适温度为60℃．