猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPL mRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103 ～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。     

基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP)(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP )DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU~(EHP))起始模板范围为2.0×10~1～2.0×10~9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%～0.72%和0.56%～0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。     

猪hsp70和hsp90荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA序列,设计并合成3对引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,系列稀释作为阳性标准品,用于标准曲线的绘制和样品检测,并用持家蛋白GAPDH基因对样品进行归一化,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测.结果证明,建立的一步法荧光定量RT-PCR技术可以真实地反映反应管中模板的数量,可用于猪hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA水平的检测.     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

血管内皮生长因子（VEGF）实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18 T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103~1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92％)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用

为定量检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法。根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果表明,该试验建立的荧光定量PCR方法在1μl 101~109拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%与100%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高,而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应,批内和批间的变异系数均低于3%,表明该方法的重复性较好。对华东地区采集的130份临床样品进行检测,结果显示,PEDV的阳性率为63.1%。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

西洋参生长过程中土壤微生物区系的动态变化

以吉林、北京两个产地不同年限西洋参根际土壤微生物为研究对象,对其土壤微生物进行分离、培养、计数和鉴定来研究土壤微生物区系的动态变化.结果显示:通过对不同生长年限的比较,西洋参根际土壤微生物有总体水平看,均有所增长,土壤理化性质也有不同程度的改变.鉴别出西洋参根际真菌的主要优势种群,并且得出西洋参根际的主要病原菌(Alternaria sp.)等和拮抗菌(Thrichoderma sp.)等随着生长年限的增加所占比例均有所增加.     

蝴蝶兰花梗腋芽离体快繁控制褐变的研究

褐变是蝴蝶兰离体培养中的常见现象,试验尝试探寻蝴堞兰花梗腋芽离体快繁过程中有效控制其褐变的方法,诱导丛生芽.试验证明:带腋芽花梗节段褐变程度比腋芽要轻;适当的暗培养有利于减轻外植体的褐变;细胞分裂素KT比BA的褐变症状要轻,但丛生芽的诱导率不如BA;适当添加一定剂量的PVP、活性炭、柠檬酸等可减轻褐变,柠檬酸、PVP效果比活性炭显著,为特色花卉的工厂化生产提供参考.     

现代园林植物景观中的中国元素应用探索

在园林景观中,植物是最重要的因素之一,中国元素是探寻中国特色园林景观的源泉.农耕文化中朴素自然观指引下的城市生态群落、适地适种原则影响下的乡土植物的回归,以及风水模式中中国古代科学的思维方式,都是遵循了天人合一,人与自然和谐相处的原则,为现代园林景观提供了生态意义上的模版.诗词文化与传统植物艺术在现代植物景观中的适当运用也会带来很好的社会效应,这些中国元素带给现代园林植物景观可探寻的应用途径及意义.     

安徽省小麦品种演变分析

摘要：安徽在我国小麦主产省份中位列第四。通过对从1950-2008近60年来安徽省小麦主要推广品种种植面积和使用情况的分析,将主推品种划分为六个阶段,约10年一个阶段。对各个阶段的主要推广品种特征特性、主要优缺点和轮替情况进行了分析,归纳出各个阶段生产的基本要求、品种的综合表现和育种的进展。并对小麦品种演变的特点进行了总结,揭示了品种冬春性变化、生产布局的调整、主导品种与搭配品种的更替频率以及日益提高的对抗病抗逆性要求。     

玉米自交系主要数量性状配合力及利用潜力分析

采用NCII遗传交配设计,对16个玉米自交系的单株粒重等15个性状的配合力进行了分析.结果表明:所测各性状配合力在P1、P2组内不同自交系间存在显著或极显著差异.P1组亲本配合力总效应大小顺序为:ZK01-1＞ZK01-2＞郑58＞9058＞248＞ZK01-3＞齐319:P2组亲本配合力总效应大小顺序为昌7-2＞ZK02-2＞ZK02-1＞LX9801＞永35-2＞H21＞ZK02-4＞ZK02-3＞黄早4.郑58改良系ZK01-1、ZK01-2在玉米育种中有较大利用价值:昌7-2改良系ZK02-2、ZK02-1在玉米育种中有较大利用价值.行粒数和粒长是决定玉米产量的主要因素,在玉米育种中应作为优先考虑的性状.     

喷施亚硒酸钠对小麦产量的影响

为了解施用硒肥对小麦籽粒含硒量、小麦产量及经济效益的影响,探讨喷施不同亚硒酸钠溶液的施肥效果,在豫东潮土上进行了小麦喷施亚硒酸钠试验.结果表明,喷施亚硒酸钠对小麦产量、经济效益有显著的影响,喷施亚硒酸钠比对照喷清水可增产小麦1691.4～2443.2 kg/hm2,增产率13.6%～15.2%,每公顷净增收益2653.2～3820.8元.喷施亚硒酸钠溶液的处理小麦籽粒中硒的含量均比喷清水处理高,可提高硒含量0.07～0.14 μg/kg,提高幅度为124.1%～148.3%,其中喷亚硒酸钠溶液浓度达到15mg/kg时效果最好,表现为籽含硒量较高,增产幅度最大,净增经济收益最多.     

不同中药对奶牛乳房炎病原菌抑菌效果的观察

试验采用琼脂平板扩散法(打孔法),研究了黄芩等21种中药对从乳房炎奶牛乳汁中分离出的3种主要致病菌的体外抑菌情况.结果发现,大肠杆菌对黄芩高度敏感,对丹参、青翘属中度敏感;金黄色葡萄球菌对黄芩、青翘、丹参、地榆、红花、蒲公英高度敏感,对枳壳、忍冬藤、篇蓄、苦地丁、蟾酥、木通中度敏感;无乳链球菌对地榆、当归属高度敏感,对青翘、黄芩、蒲公英、丹参、苦地丁、红花、川芎、枳壳中度敏感.为防治奶牛乳房炎有效中药复方的筛选提供了理论依据.     

两种细菌粗多糖对草鱼的免疫调节作用

目的检测细菌多糖对草鱼的免疫调节作用。方法用酚水法分别从大肠杆菌和根癌农杆菌细胞壁中提取出粗多糖，注射草鱼,测定受试草鱼血液中白细胞数量，血清中抗体效价，肝脏、肾脏、脾脏、血清和粘液中过氧化物酶的活力。结果受试草鱼中的白细胞数量、血清抗体效价及过氧化物酶活力均具有明显提高。结论大肠杆菌和根癌农杆菌粗多糖对草鱼有免疫促进作用。     

甘蓝型黄籽油菜性状组间的典型相关分析

以7个不同遗传来源的甘蓝型黄籽品系所配制的完全双列杂交作样本．对甘蓝型黄籽油菜进行典型相关分析。结果表明,在性状组间关联上起主要作用的是株型性状中的株高、产量性状中的单株粒重、品质性状中的皮壳率和黄籽度。用多目标综合选择指数．讨论了甘蓝型黄籽油菜的选择问题。     

金佛山野生百合属植物资源及开发利用

经调查统计,金佛山野生百合属植物有11种(含变种),其中本地特产1种,模式标本采自金佛山的有2种.此文就金佛山野生百合属资源的开发利用提出建议.